高效液相色譜法測定嬰幼兒乳粉中煙酰胺的不確定度評定

霍艷敏，王艷麗，王 駿，周莉莉，祝建華，張 卉，薛 霞

(山東省產品質量監督檢驗研究院，國家加工食品質量監督檢驗中心(山東)，山東 濟南 250103)

高效液相色譜法測定嬰幼兒乳粉中煙酰胺的不確定度評定

霍艷敏，王艷麗，王 駿，周莉莉，祝建華，張 卉，薛 霞

(山東省產品質量監督檢驗研究院，國家加工食品質量監督檢驗中心(山東)，山東 濟南 250103)

建立高效液相色譜法測定嬰幼兒乳粉中煙酰胺不確定度的數學模型，并根據JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》和JJF 1059—1999《測量不確定度評定與表示》中的有關規定，逐層對乳粉中煙酰胺測量不確定度來源進行評估，最后給出合成標準不確定度和擴展不確定度；嬰幼兒乳粉中煙酰胺測定結果為(63.01±3.50)mg/kg，k=2，p=95%。通過評定，提出影響檢測結果的主要因素為樣品前處理過程、標準溶液、標準曲線擬合等。

不確定度；煙酰胺；嬰幼兒乳粉；高效液相色譜法

測量不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性、與測量結果相聯系的參數[1]。測量不確定度的大小反映了測量結果質量的高低，并直接與檢驗結果的合格判定相關，因此完整的測量結果表示應該包括測量不確定度。煙酰胺是嬰幼兒乳粉中重要的營養成分，它與蛋白質的代謝及兒童智力發育關系極大。GB2760—2007《食品添加劑使用衛生標準》[2]規定煙酰胺在嬰兒配方食品和較大嬰兒和幼兒配方食品中的限量為3～26mg/100g。為了保證嬰幼兒乳粉中煙酰胺的檢測結果的準確性，本實驗依據JJF 1059—1999《測量不確定度評定與表示》[1]和JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》[3]對煙酰胺測量過程不確定度的各個分量進行評價，并給出擴展不確定度，以期使該不確定度的給出可以作為改善煙酰胺測量程序，提高測量精密度和準確性的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為市場隨機抽查的嬰兒奶粉。

煙酰胺標準品(純度＞99.5%) 德國Dr. Ehrenstorfer公司；七氟丁酸 美國Alfa公司；甲醇(色譜純)；磷酸二氫鉀(分析純)。

1.2 儀器與設備

2695高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器) 美國Waters公司；AB204-S電子天平(感量0.0001g) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ5200超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；pHS型酸度計 上海偉業儀器廠。

1.3 樣品處理

按照GB 5413.15—2010《食品安全國家標準：嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定》[4]進行。

1.4 色譜條件

色譜柱：Atlantis C18柱(25cm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇:50mmol/L磷酸二氫鉀-0.4mmol/L七氟丁酸=5:95(V/V)[5]；流速：1.0mL/min；檢測波長260nm；柱溫：35℃；進樣量：10μL。

1.5 煙酰胺質量分數計算

式中：X為樣品中煙酰胺質量分數/(mg/kg)；c為由標準曲線得出的試樣中煙酰胺的質量濃度/(mg/L)；m為樣品質量/g；V為樣品測試液定溶體積/mL；r為加標回收率。

2 結果與分析

2.1 不確定度的來源分析

從測量過程和數學模型分析，煙酰胺含量測定的不確定度主要來源于標準物質、標準物質工作曲線的擬合、樣品稱量、定容體積、樣品的制備和測試過程的差異等幾個方面[6-9]。

2.2 不確定度的評定

2.2.1 標準物質及配制過程引入的相對不確定度

2.2.1.1 標準物質引入的相對不確定度

根據標準物質證書提供的信息，煙酰胺的不確定度為0.5%，包含因子k＝2，屬B類評定，其相對標準不確定度為：

2.2.1.2 標準溶液配制過程中引入的相對不確定度

(1) 標準物質稱量引入的相對不確定度

標準儲備液配制的過程是精確稱取25.00mg煙酰胺標準物質，加水溶解并定容至25mL容量瓶。根據稱量使用的電子天平檢定證書，其最大允許誤差0.5mg，重復性誤差0.1mg，一般采用矩形分布，包含因子為，屬B類評定。其標準不確定度為：

合成標準不確定度為：

(2) 標準溶液配制過程中玻璃器具校準引入的相對不確定度

標準工作液配制過程中使用了一系列玻璃器具，按照JJG 196—2006《常用玻璃量具檢定規程》[10]的要求，均有相應的最大允差。按均勻分布處理，k＝計算不確定度分量。玻璃量具校準的不確定度見表1。

表1 標準溶液配制過程中玻璃器具校準引入的不確定度Table 1 Uncertainty resulting from the errors during the calibration of volumetric flasks and pipettes for standard solution preparation

由表1中的數據合成的相對不確定度為：

(3) 標準工作液配制過程溫度變化引入的相對不確定度

玻璃器具在20℃進行校正，而實驗室的溫度一般為(20±5)℃，由溫度波動引起的不確定度可通過估算溫度范圍和體積膨脹系數進行計算，液體的膨脹系數遠高于玻璃的膨脹系數，所以玻璃的膨脹系數可忽略。標準工作液是用水稀釋配制，水的膨脹系數為2.1×10-4℃-1，計算標準不確定度時，假設溫度變化為矩形分布，即k＝。

表2 標準溶液配制過程中溫度變化引入的不確定度Table 2 Uncertainty resulting from temperature change during standard solution preparation

由表2數據合成的相對標準不確定度為：

因此，由標準物質本身、天平、玻璃器具校準和溫度變化的不確定度分量合成標準溶液的相對標準不確定度為：

2.2.2 標準工作曲線擬合引入的相對不確定度

配制質量濃度分別為0.995、2.49、4.98、9.95μg/mL的煙酰胺標準使用溶液，每個質量濃度水平平行測量3次，用最小二乘法擬合標準溶液質量濃度-峰面積曲線，標準曲線數據見表3。

根據表3數據，采用最小二乘法擬合標準曲線，得曲線方程為：y＝1.53×104x－1.55×103(式中，y為峰面積、x為煙酰胺含量、b＝1.53×104、a＝1.55×103，相關系數為0.9998)。

乳粉樣品經測定6次后，由線性方程得到測試液中煙酰胺質量濃度(c)為2.510μg/mL，由擬合曲線求c時產生的標準不確定度為：

式中：SR為從標準曲線求得的峰面積Y與相應測得的峰面積Yi之差所求出的標準偏差；m為樣品溶液的測定總次數，此處m為6；n為標準溶液的測定總次數，此處n為12；c為樣品中煙酰胺質量濃度的平均值；c0為標準溶液中煙酰胺質量濃度的平均值：ci為標準溶液中煙酰胺的質量濃度。

2.2.3 乳粉重復測定引入的相對不確定度

表4 乳粉樣品重復測定結果Table 4 Replicate determination results of nicotinamide in infant formula milk powder

乳粉樣品重復測定6次，結果見表4。通過重復測量樣品進行評定，它包含試樣前處理過程、使用器皿、儀器及進樣量的不確定度，根據JJF 1135—2005的規定，該不確定度屬A類評定。所測結果X平均值的標準不確定度uX采用平均值的標準偏差s(X)表征。計算公式如下：

2.2.4 樣品前處理過程引入的相對標準不確定度

2.2.4.1 樣品稱量引入的相對不確定度

稱取2.0g(精確到0.0001g)樣品，由此引起的相對不確定度為：

2.2.4.2 樣品定容引入的相對不確定度

樣品經過處理使用50mL容量瓶定容，其最大允許誤差為±0.05，按均勻分布，容量瓶檢定的標準不確定度為。因容量瓶在使用和校準時存在溫度波動，一般為±5℃，按均勻分布，由此產生的不確定度為5×50×2.1×10-4÷ 3÷50＝6.06×10-4。

由定容體積引入的相對標準不確定度為：

2.2.4.3 添加回收率引入的相對不確定度[11]

樣品前處理過程中煙酰胺存在損失，通過樣品添加煙酰胺計算回收率，5次樣品添加回收率的結果分別為92.3%、92.0%、98.1%、98.3%、102.0%，平均回收率為r=96.54%，標準偏差s為00.043，標準不確定度采用平均值的標準偏差，標準不確定度為：

為了確定回收率是否歸入煙酰胺質量分數數學模型的計算中，需對回收率進行顯著性檢驗：

結果P＝0.95、f＝4時，t0.05,4=2.78。由于t＜t0.05,4，說明r與1無顯著差異，r值不必使用。

因此，由樣品處理過程產生的相對不確定度為：

2.2.5 分析儀器引入的相對標準不確定度

該高效液相色譜儀的定量重復性(以RSD表示)為1.1%，測定值一般為對稱分布，則：

2.3 乳粉中煙酰胺質量分數的相對標準不確定度來源匯總

表5 乳粉中煙酰胺質量分數的相對標準不確定度來源匯總表Table 5 List of relative standard uncertainties for nicotinamide determination of infant formula milk powder

根據2.2節結果得到乳粉中煙酰胺質量分數的相對標準不確定度來源見表5。

2.4 合成標準不確定度

根據前述結果，得到高效液相色譜法測定嬰幼兒乳粉中煙酰胺的不確定度為：

2.5 擴展不確定度

依據JJF 1135—2005，對于大多數測量，采用置信概率p＝95%、包含因子k=2衡量，則擴展不確定度為u＝uf×2＝3.50mg/kg。

3 結 論

通過對影響乳粉中煙酰胺測定不確定度各分量的評價，可見測定過程中對不確定度貢獻最大的是樣品前處理過程、標準溶液配制及標準曲線的擬合過程，今后應在這幾方面加以改進，以進一步提高檢測質量。嬰幼兒乳粉中煙酰胺測定結果為(63.01±3.50)mg/kg，k＝2，p＝95%。

[1] JJF 1059—1999測量不確定度評定與表示[S].

[2] GB 2760—2007食品添加劑使用衛生標準[S].

[3] JJF 1135—2005化學分析測量不確定度評定[S].

[4] GB 5413.15—2010嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定[S].

[5] 劉娜, 陳大舟, 湯樺, 等. 嬰兒配方奶粉中8種水溶性維生素的高效液相色譜同時測定[J]. 分析測試學報, 2008, 27(4): 408-411.

[6] 蔡秋, 朱明. 高效液相色譜法測定茶飲料中苯甲酸結果不確定度評定[J]. 食品科學, 2007, 28(2): 277-280.

[7] 楊洋, 徐春祥, 車文軍. 高效液相色譜法測定乳粉中的三聚氰胺及其不確定度分析[J]. 食品科學, 2010, 31(4): 250-253.

[8] 戚榮平. 高效液相色譜儀測定醬油中苯甲酸的不確定度[J]. 浙江預防醫學, 2006, 18(2): 封三-封四.

[9] 汪輝, 曹小彥, 胡朝暉. 高效液相色譜法測定小麥粉與大米粉中甲醛次硫酸氫鈉含量的不確定度評定[J]. 食品科學, 2009, 30(12): 205-208.

[10] JJG 196—2006常用玻璃量器檢定規程[S].

[11] 嚴鳳, 張文剛, 李丹妮. 液相色譜-串聯質譜法測定動物源食品中氯霉素殘留量不確定度分析[J]. 上海畜牧獸醫通訊, 2008(5):32-33.

Uncertainty Evaluation for Nicotinamide Determination in Infant Formula Milk Powder by High Performance Liquid Chromatography

HUO Yan-min，WANG Yan-li，WANG Jun，ZHOU Li-li，ZHU Jian-hua，ZHANG Hui，XUE Xia
(National Center for Quality Supervision and Inspection of Processed Food (Shandong), Shandong Supervision and Inspection Institute for Product Quality, Jinan 250103, China)

A mathematical model was established to evaluate the uncertainty of determining nicotinamide in infant formula milk powder by high performance liquid chromatography with diode-array detection. According to the relevant regulations given in JJF 1135-2005Evaluation ofUncertaintyinChemical Analysis Measurementand JJF 1059－1999EvaluationandExpressionofUncertaintyinMeasurement, the sources of uncertainty for determining nicotinamide in infant formula milk powder were explored. Finally, the standard uncertainty and the expanded uncertainty were achieved. The content of nicotinamide in infant formula milk powder determined by HPLC was (63.01 ± 3.50) mg/kg. The major sources of uncertainty affecting determination results were pre-treatment, standard solution and standard curve fitting.

uncertainty；nicotinamide；infant formula milk powder；high performance liquid chromatography(HPLC)

O657.72

A

1002-6630(2011)16-0330-04

2010-11-10

霍艷敏(1981—)，女，工程師，碩士，研究方向為食品檢測。E-mail：huoyanmin0628@163.com