葡萄籽中原花青素提取工藝

肖麗霞，何志貴,3，朱 勇，曾慶文，胡博然,*

(1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.桂林旅游高等專學(xué)校，廣西 桂林 541006)

葡萄籽中原花青素提取工藝

肖麗霞1，何志貴1,3，朱 勇2，曾慶文1，胡博然1,*

(1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.桂林旅游高等專學(xué)校，廣西 桂林 541006)

以發(fā)酵后葡萄籽為原料，研究微波、纖維素酶和超聲波輔助提取葡萄籽中原花青素的工藝條件，對(duì)影響原花青素提取率的因素進(jìn)行考察，通過正交試驗(yàn)確定葡萄籽中原花青素的最佳提取工藝。結(jié)果表明最佳方法為微波輔助提取，其最佳工藝條件：料液比1:25(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、微波時(shí)間40s、微波功率115W，原花青素的提取率為10.70%。

葡萄籽；原花青素；微波；酶解；超聲波

原花青素是從葡萄籽中提取出來的多酚類黃酮，主要是以兒茶素或表兒茶素為單體縮合而成的聚合物，還含有少量的兒茶素和表兒茶素、咖啡酸等有機(jī)酸，它們以復(fù)雜成分和協(xié)同方式起抗氧化作用，使其具有高度的生物利用度。原花青素具有多種藥理活性，如抗氧化、清除自由基、護(hù)肝解毒、抗菌及抗癌等功能[1-6]。

隨著我國葡萄酒業(yè)的發(fā)展，葡萄籽作為葡萄酒工業(yè)中的副產(chǎn)品也逐年增加。目前國內(nèi)對(duì)葡萄籽的綜合利用還比較低，只是簡(jiǎn)單地提取葡萄籽油或者是被用來當(dāng)作飼料使用。將葡萄籽中的活性成分進(jìn)行提取利用，能使葡萄籽得到充分利用，同時(shí)還能提高葡萄酒加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[7-8]。

微波萃取是近年才發(fā)展起來的一門新技術(shù)，最大的特點(diǎn)是作用時(shí)間短，提取效率高，有效成功破壞小，節(jié)約能量等[9-11]。超聲波被廣泛應(yīng)用于中草藥有效成分的提取分離，由于這種技術(shù)具有快速、能耗低、提取率高的特點(diǎn)[12-14]，受到越來越多的關(guān)注。高等植物細(xì)胞壁具有一定硬度和彈性的固體結(jié)構(gòu)，主要由纖維素形成其網(wǎng)狀框架，因此可以使用纖維素酶降解纖維素，使細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)疏松瓦解，從而提高有效成分的提取率[15-16]，具有條件溫和、節(jié)約能源、提取率高、除雜等優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用微波、纖維素酶和超聲波輔助提取3種方法對(duì)葡萄籽中原花青素的提取工藝進(jìn)行研究，最終確定最適宜的提取方法及工藝條件，為葡萄籽中原花青素的提取和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽由江蘇太倉產(chǎn)地的釀酒葡萄赤霞珠經(jīng)發(fā)酵后，過濾去皮獲得。

兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品 南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司；纖維素酶 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；香草醛 醫(yī)藥集團(tuán) 上海化學(xué)試劑公司；濃硫酸 中國恒利試劑廠出品；無水乙醇 西隴化工股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

V-1600PC分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；FW135型粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；RE52-4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海滬西分析儀器有限公司；DL-120B型超聲波清洗器 上海三信儀器有限公司；TG16A-WS型離心機(jī) 盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將葡萄籽30℃烘干、粉碎，用石油醚浸泡48h，抽濾，烘干備用。

1.3.2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用硫酸-香草醛法[17]。精確稱取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品配制成1.0mg/mL對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0、2、4、6、8mL定容到10mL，再各取0.5mL，依次加入2.5mL 30g/L的香草醛-甲醇溶液和2.5mL 30%濃硫酸-甲醇溶液，搖勻后于30℃水浴避光反應(yīng)30min，然后測(cè)定A500nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y＝0.5839x－0.0071(式中，y為吸光度，x為兒茶素質(zhì)量濃度，R2＝0.9990)。

1.3.3 葡萄籽中原花青素的提取及測(cè)定

準(zhǔn)確稱取葡萄籽粉1.0g，在一定條件下進(jìn)行提取，合并濾液，減壓濃縮，回收乙醇，定容后得原花青素提取液。吸取0.5mL原花青素提取液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定原花青素質(zhì)量濃度，每樣做平行3次，計(jì)算原花青素提取率。

式中：PC為樣品中原花青素提取率/%；X為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得的樣品中原花青素質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V1為取樣體積/mL；V2為定容后樣品總體積/mL；m為原料質(zhì)量/g。

1.3.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究微波、纖維素酶和超聲波輔助3種方法提取葡萄籽中原花青素的工藝條件，對(duì)影響原花青素提取率的因素進(jìn)行考察，通過單因素及正交試驗(yàn)確定葡萄籽中原花青素的最佳提取工藝。比較3種方法的優(yōu)劣，確定最佳提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助提取葡萄籽中原花青素試驗(yàn)

圖1 各因素對(duì)微波輔助提取葡萄籽中原花青素的影響Fig.1 Effects of various microwave-assisted extraction parameters on extraction rate of proanthocyanidins

2.1.1 料液比對(duì)提取率的影響

如圖1a所示，在其他條件一定的情況下，原花青素提取率隨著提取液用量增加而增加，當(dāng)料液比為1:20時(shí)，提取率達(dá)到8.02%，隨著提取液用量的進(jìn)一步加大，其提取率有所降低。因此，選擇1:20為最佳料液比。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

如圖1b所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，原花青素的提取率達(dá)到最高值7.3%。因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，水的含量相應(yīng)較高，則原花青素提取率會(huì)降低；而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)脂溶性物質(zhì)容易溶出，從而降低原花青素的提取率。因此，選擇70%為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.1.3 微波時(shí)間對(duì)提取率的影響

如圖1c所示，微波作用時(shí)間越長(zhǎng)，原花青素提取率越高，微波超過50s后，提取率呈下降趨勢(shì)，這是由于隨著時(shí)間的增加，料液溫度升高，使得熱穩(wěn)定性較差的原花青素被破壞。因此，選擇50s作為最佳提取時(shí)間。

2.1.4 微波功率對(duì)提取率的影響

如圖1d所示，隨著微波功率的增加，提取物加熱的速度加快，原花青素越容易被提取出來，當(dāng)微波功率在115W時(shí)，提取率達(dá)到最大為7.85%。隨著微波功率的進(jìn)一步加大，提取率急劇降低，因?yàn)槲⒉üβ蔬^大使得溫度過高，原花青素?fù)p失越多。此外，在較高功率下乙醇溶液容易沸騰以至沖出三角瓶，影響試驗(yàn)結(jié)果。因此，選擇115W為最佳提取功率。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

葡萄籽經(jīng)一次提取后，其中的有效成分不會(huì)立即提取完全，為考察原花青素經(jīng)過多次提取后，原花青素的含量變化情況及工作需要，采用同樣的步驟，對(duì)一定量的葡萄籽進(jìn)行多次提取實(shí)驗(yàn)。如圖1e所示，經(jīng)過兩次提取后，葡萄籽中的原花青素得率均在2%以上，3次提取時(shí)原花青素得率則較低，兩次提取較為合理。

2.1.6 葡萄籽中原花青素微波提取正交試驗(yàn)

根據(jù)以上分析，在兩次提取的情況下，對(duì)影響原花青素提取率主要因素料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波時(shí)間、微波功率進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，研究這些因素對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響，因素水平見表1。

表1 微波輔助提取葡萄籽中原花青素正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design for optimizing microwave-assisted proanthocyanidins extraction

表2 微波輔助提取葡萄籽中原花青素正交試驗(yàn)結(jié)果與分析(n=3)Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results for optimizing microwave-assisted proanthocyanidins extraction(n=3)

由表2可知，影響原花青素提取效果各因素為料液比＞微波功率＞微波時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)，料液比對(duì)提取率影響最大，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率影響最小；最佳提取條件組合為A3B3C1D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)8 0%、料液比1:2 5、微波時(shí)間4 0 s、微波功率115W。在最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到原花青素提取率為10.70%，高于各試驗(yàn)組，說明正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.2 纖維素酶輔助提取葡萄籽中原花青素試驗(yàn)

圖2 各因素對(duì)纖維素酶輔助提取原花青素的影響Fig.2 Effects of various cellulase hydrolysis-based extraction parameters on extraction rate of proanthocyanidins

2.2.1 酶添加量對(duì)提取率的影響

如圖2a所示，酶添加量在300U/mg時(shí)，原花青素的提取率最高。酶添加量過低時(shí)，酶未被底物飽和；酶添加量較高時(shí)，可能由于溶液中的抑制劑與酶結(jié)合導(dǎo)致酶活降低。因此，選擇300U/mg為最佳酶添加量。

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響

如圖2b所示，酶和底物作用的時(shí)間對(duì)原花青素提取率的作用并不明顯。開始作用時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率也相對(duì)升高，作用時(shí)間為1.5h時(shí)達(dá)到最高，之后隨著時(shí)間的增加，提取率呈下降趨勢(shì)。可能原因是：時(shí)間較短，酶與底物反應(yīng)不完全，原花青素還沒有完全溶出，時(shí)間較長(zhǎng)，原花青素已大部分溶出，且隨著在空氣中暴露的時(shí)間增加，發(fā)生氧化損失，所以含量呈下降趨勢(shì)。因此，選擇1.5h為最佳提取時(shí)間。

2.2.3 pH值對(duì)提取率的影響

酶活性的發(fā)揮與它所處的pH值環(huán)境有關(guān)，過酸或過堿可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶構(gòu)象的改變，酶活性受到抑制或喪失。如圖2c所示，pH4時(shí)，原花青素的提取率最高。綜合考慮，選擇最適pH4。

2.2.4 酶解溫度對(duì)提取率的影響

如圖2d所示，隨著溫度的升高，原花青素的提取率逐漸升高，50℃時(shí)達(dá)到最高，超過50℃后，隨著溫度的升高，原花青素的提取率降低，可見50℃是該反應(yīng)條件下纖維素酶的最適溫度，故選50℃為最佳提取溫度。2.2.5 酶法輔助提取葡萄籽中原花青素正交試驗(yàn)

根據(jù)以上的分析，在兩次提取的情況下，對(duì)影響原花青素提取率的主要因素酶添加量、酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，研究這些因素對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響，因素水平見表3。

表3 纖維素酶輔助提取葡萄籽中原花青素正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and their coded levels in orthogonal array design for optimizing cellulase hydrolysis-based proanthocyanidins extraction

表4 纖維素酶輔助提取葡萄籽中原花青素的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 (n=3)Table 4 Orthogonal array design and corresponding experimental results for optimizing cellulase hydrolysis-based proanthocyanidins extraction (n=3)

由表4可知：影響原花青素提取效果各因素為酶解溫度＞pH值＞酶解時(shí)間＞纖維素酶添加量；最佳組合為A1B1C1D1，即纖維素酶添加量100U/mg、酶解時(shí)間1.0h、pH4.0、酶解溫度45℃。在最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到原花青素提取率8.75%，說明正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.3 超聲波輔助提取葡萄籽中原花青素試驗(yàn)

圖3 各因素對(duì)超聲波輔助提取葡萄籽中原花青素的影響Fig.3 Effects of various ultrasonic-assisted extraction parameters on extraction rate of proanthocyanidins

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

如圖3a所示，原花青素的提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，原花青素的提取率最高達(dá)到2.61%，之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，原花青素的提取率下降。其原因可能是：當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，溶出的醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分增加，它們同原花青素競(jìng)爭(zhēng)與乙醇-水分子結(jié)合，同時(shí)植物組織的通透性下降，都會(huì)導(dǎo)致原花青素的提取率降低。因此，確定60%為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.3.2 料液比對(duì)提取率的影響

如圖3b所示，隨著提取液的增加，原花青素的提取率增大，但達(dá)到一定程度后，再增大料液比，提取率趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)槿軇┯昧窟_(dá)到一定程度后，葡萄籽中原花青素已經(jīng)基本全部溶出，再增加溶劑的用量不僅造成不必要的浪費(fèi)，而且還給后續(xù)加工增加麻煩。因此，提取液的用量不宜太大，故選擇1:30作為最佳料液比。

2.3.3 超聲溫度對(duì)提取率的影響

原花青素的提取率與提取溫度密切相關(guān)，一般來說，冷提雜質(zhì)少；熱提效率高，但是雜質(zhì)也相對(duì)較多。確定一個(gè)適宜的溫度不僅可以增加提取率，而且還有利于原花青素的純化。如圖3c所示，隨著溫度的升高，原花青素的提取率也隨之增加，但當(dāng)超過一定值后，隨著溫度的升高，提取率卻有所下降。這是因?yàn)樵ㄇ嗨責(zé)岱€(wěn)定性較差，過高的溫度不僅會(huì)使原花青素發(fā)生聚合氧化，而且會(huì)使提取的雜質(zhì)含量增加。因此，選擇45℃為最佳提取溫度。

2.3.4 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

如圖3d所示，隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，原花青素的提取率逐漸提高，但當(dāng)超過25min時(shí)，原花青素的提取率有所下降。這主要是因?yàn)樵ㄇ嗨亻L(zhǎng)時(shí)間受熱部分結(jié)構(gòu)被破壞，造成提取率下降。因此，選擇25min作為最佳提取時(shí)間。

2.3.5 超聲功率對(duì)提取率的影響

如圖3e所示，超聲波功率增加，原花青素的提取率也增加，在達(dá)到80W后，原花青素的提取率反而下降。功率增大有利于原花青素的提取，但是功率過大則會(huì)產(chǎn)生大量的熱量使得原花青素的結(jié)構(gòu)被破壞。

2.3.6 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

考慮到葡萄籽經(jīng)一次提取，其中的有效成分不會(huì)提取完全，采用同樣的步驟，對(duì)一定量的葡萄籽進(jìn)行多次提取實(shí)驗(yàn)，由圖3f可知：3次提取時(shí)，原花青素提取率很低，從工作量、生產(chǎn)成本等因素考慮，兩次提取較為合理。2.3.7 葡萄籽中原花青素超聲波提取正交試驗(yàn)

表5 超聲波輔助提取葡萄籽中原花青素正交試驗(yàn)因素水平Table 5 Factors and their coded levels in orthogonal array design for optimizing ultraonic-assisted proanthocyanidins extraction

表6 超聲波輔助提取原花青素的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=3)Table 6 Orthogonal array design and corresponding experimental results for optimizing ultrasonic-assisted proanthocyanidins extraction(n=3)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，可以得出原花青素提取率的主要影響因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率。超聲溫度影響較小，不予考慮，選定溫度45℃。在兩次提取的情況下，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率4因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，選擇L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表5。

由表6可知：影響原花青素提取效果各因素為超聲時(shí)間＞料液比＞超聲波功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)；得出最佳提取條件組合為A1B3C3D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1:35、超聲時(shí)間30min、超聲波功率80W。在最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，原花青素提取率為5.57%，高于各試驗(yàn)組，說明正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié) 論

通過比較微波、纖維素酶和超聲波輔助提取葡萄籽中原花青素的提取工藝，發(fā)現(xiàn)微波輔助提取優(yōu)于其他兩種方法。從提取時(shí)間來看，微波法能明顯縮短提取時(shí)間，提取時(shí)間遠(yuǎn)小于其他兩種方法，微波提取僅需40s，而其他兩種方法都需時(shí)間較長(zhǎng)；從原花青素提取率來看，微波法與纖維素酶法、超聲波法相比，分別提高22.3%、92.1%。綜合以上因素，葡萄籽中原花青素最佳方法為微波法，最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1:25、微波時(shí)間40s、微波功率115W，原花青素提取率為10.70%。

本研究為葡萄籽中原花青素的提取與開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為葡萄籽中原花青素的開發(fā)利用提供了參考。

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Optimization of Proanthocyanidin Extraction from Grape Seed

XIAO Li-xia1，HE Zhi-gui1,3，ZHU Yong2，ZENG Qing-wen1，HU Bo-ran1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；2. College of Biological Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；3.Guilin Institute of Tourism, Guilin 541006, China)

The aim of this study was to optimize technical conditions for ultrasonic-assisted ethanol extraction, cellulase hydrolysis-based extraction and microwave-assisted ethanol extraction of proanthocyanidins from grape seed power using onefactor-at-a-time coupled with orthogonal array design method. Microwave-assisted extraction was found to be the best of the three methods, and the optimal process conditions were ethanol concentration of 80%, material-to-liquid ratio of 1:25 (g/mL),microwave treatment time of 40 s and microwave power of 115 W. Under these conditions, the extraction rate of proanthocyanidins was 10.70%.

grape seed；proanthocyanidins；microwave；cellulose；ultrasonic

R284.2

A

1002-6630(2011)20-0089-06

2011-05-31

海南省重點(diǎn)科技項(xiàng)目(070121；ZDXM20100005)

肖麗霞(1966—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏加工。E-mail：lxxiao@yzu.edu.cn

*通信作者：胡博然(19 64—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槠咸丫啤⑹称飞锛夹g(shù)、食品安全。E-mail：huboran2001@yahoo.com.cn