黃山貢菊高效液相色譜指紋圖譜的建立

査芳芳，高學(xué)玲,*，鄒敏亮，何常明，賀曼曼

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.健士星生物技術(shù)研發(fā)(上海)有限公司，上海 200335)

黃山貢菊高效液相色譜指紋圖譜的建立

査芳芳1，高學(xué)玲1,*，鄒敏亮2，何常明2，賀曼曼1

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.健士星生物技術(shù)研發(fā)(上海)有限公司，上海 200335)

目的：研究黃山貢菊高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，為其質(zhì)量控制和科學(xué)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定28種不同來源的菊花樣品，用藥典委員會(huì)頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A進(jìn)行評(píng)價(jià)，建立共有模式。結(jié)果：建立了黃山貢菊的指紋圖譜，確定了12個(gè)共有峰，各貢菊樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜相似度均在0.96以上，與其他菊花品種的相似度均小于0.86。結(jié)論：此方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于黃山貢菊藥材質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。

黃山貢菊；高效液相色譜法(HPLC)；指紋圖譜；相似度

黃山貢菊亦稱“徽州貢菊”，產(chǎn)自著名的旅游勝地黃山地區(qū)，與杭菊、亳菊、滁菊共同收載于2010年版《中國(guó)藥典》[1]。貢菊為多年生草本菊科植物菊(Chrysanthemum morifoliumRamat.)的頭狀花序，具有疏風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒之功效，用于風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒等癥[1]。現(xiàn)代研究表明，黃山貢菊主要活性成分包括酚酸、黃酮及其苷類、揮發(fā)油等[2-4]，具有抗菌、抗氧化、降低血壓和調(diào)節(jié)血脂含量等多方面藥理作用[5-7]。黃山貢菊既有觀賞價(jià)值，又有飲用和藥用功能，是藥食兼用之佳品。

目前，關(guān)于黃山貢菊藥材的質(zhì)量控制大部分還停留在藥材性狀鑒別和沖泡時(shí)風(fēng)味口感等感官鑒別上，僅有部分文獻(xiàn)對(duì)菊花其他品種高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)指紋圖譜進(jìn)行研究[8-10]，尚未見關(guān)于黃山貢菊中主要成分酚酸及黃酮類化合物的鑒別及指紋圖譜研究的報(bào)道。本研究應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)不同種植地、采摘批次的黃山貢菊及其他品種菊花的主要功效成分酚酸及黃酮類化合物進(jìn)行指紋圖譜研究，以期為貢菊的質(zhì)量控制建立有效方法，并為藥材鑒別和規(guī)范種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用黃山貢菊(GJ-4)均采自黃山貢菊各種植地，其他菊花購(gòu)于各主產(chǎn)地藥材公司，所有菊花樣品均由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院何常明博士鑒定。

木犀草苷、綠原酸、1,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸對(duì)照品(純度≥98%) 成都曼思特生物科技有限公司；甲酸(色譜純) 美國(guó)Tedia公司；乙腈(色譜純) 德國(guó)Merck公司；超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜系統(tǒng)(配有四元泵、在線真空脫氣系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD檢測(cè)器、Chem Station工作站) 美國(guó)Agilent公司；RUC-5200型超聲波清洗機(jī) 上海睿祺公司；TL-5.0W臺(tái)式離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus Phenyl- Hexyl(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫程序見表1；流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)327nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量5μL。以木犀草苷的色譜峰計(jì)算理論塔板數(shù)不低于7萬。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution program for HPLC fringerprinting of Huangshan Gongju chrysanthemum

1.3.2 對(duì)照品溶液制備

精確稱取木犀草苷對(duì)照品適量，置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得含0.04g/L木犀草苷溶液，0.45μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3.3 供試品溶液的制備

精密稱取菊花粉碎樣1g(過24目篩)，先用20mL 75%乙醇浸泡30min，再放入50℃超聲提取器超聲提取30min，用濾紙進(jìn)行抽濾，濾液用75%乙醇定容至100mL容量瓶中，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，濾液貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 樣品測(cè)定

按1.3.3節(jié)條件制備28種不同來源菊花供試品溶液，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取黃山貢菊樣品(GJ-4)供試液，按1.3.1節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，相似度結(jié)果均在0.99以上，各色譜峰峰面積的 RSD值小于1.2%。

2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取黃山貢菊樣品(GJ-4)供試液，分別在0、2、4、8、12、24h按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，各主要色譜峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.014%～0.140%，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.205%～3.543%。結(jié)果表明，黃山貢菊供試液在室溫條件24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一貢菊樣品(GJ-4)6份，按1.3.3節(jié)方法制備供試液，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算出相似度在均在0.99以上，各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%，表明重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

表2 黃山貢菊HPLC指紋圖譜相對(duì)保留時(shí)間Table 2 Relative retention time of main peaks in the HPLC fingerprint of Huangshan Gongju chrysanthemum

表3 黃山貢菊HPLC指紋圖譜峰面積Table 3 Relative areas of main peaks in the HPLC fingerprint of C. morifolium Ramat.

2.4 黃山貢菊 HPLC指紋圖譜中的特征峰

根據(jù)13個(gè)不同來源貢菊的 HPLC指紋圖譜的檢測(cè)結(jié)果，確定12個(gè)共有色譜峰，共有峰面積占總峰面積比例的90%以上；除對(duì)照峰3為木犀草苷外，峰1、6、7經(jīng)與對(duì)照品比較，分別鑒定為綠原酸、1,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸。以峰3(木犀草苷)為內(nèi)參比峰，結(jié)果顯示黃山貢菊樣品指紋圖譜中共有峰相對(duì)保留時(shí)間為0.446～2.214min，相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.001%～0.130%(表2)，表明所有貢菊花樣品出峰時(shí)間一致，色譜條件穩(wěn)定、可靠；峰面積的RSD值為17.1%～41.2%(表3)。通過對(duì)照品比較及紫外吸收特征，將12個(gè)共有峰分為2類，Ⅰ為酚酸類(包括峰1、2、5、6、7、10、12)；Ⅱ?yàn)辄S酮類(包括峰3、4、8、9、1 1)。

2.5 各菊花樣品的指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

從各產(chǎn)地采集的菊花樣品，采用藥典委員會(huì)編寫的“中藥色譜指紋圖譜相似度系統(tǒng)2004A”軟件，生成貢菊藥材共有模式的對(duì)照指紋圖譜(圖1)，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表4，各菊花樣品疊加指紋圖譜見圖2，菊花及金銀花樣品指紋圖譜見圖3。根據(jù)相似度結(jié)果，不同種植地、不同采收時(shí)間的黃山貢菊被正確區(qū)分出來，相似度在0.96～1.00之間，而與其他品種菊花樣品的相似度均小于0.86。

圖1 黃山貢菊HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig.1 Control HPLC chromatogram of 13 Huangshan Gongju chrysanthemum

表4 與共有模式比較的各樣品相似度評(píng)價(jià)Table 4 Similarity evaluation of 28 Huangshan Gongju chrysanthemum samples with the common pattern

圖2 菊花樣品指紋圖譜Fig.2 Overlapped HPLC fingerprint chromatograms of 28 Huangshan Gongiu chrysanthemum samples

圖3 菊花及金銀花樣品指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprint chromatograms of Huangshan Gongju chrysanthemum and Lonicera japonica flower

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃山貢菊進(jìn)行了HPLC指紋圖譜研究，結(jié)果表明，不同來源的貢菊化學(xué)成分既有相關(guān)性，又有所區(qū)別。所有貢菊樣品共有峰一致，表明所含化學(xué)成分相近，主要為酚酸和黃酮類成分；但受種植地、采摘時(shí)間等因素的影響，各色譜峰的峰面積相差很大(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為17.1%～41.2%)，即表明不同成分相對(duì)含量有明顯差異。GJ-6、GJ-7、GJ-8是為同一種植地不同時(shí)間采集的3批貢菊樣品，其中11月中旬和12月上旬采收的貢菊內(nèi)成分含量遠(yuǎn)低于11月下旬的含量，表明11月下旬采收的貢菊質(zhì)量最佳。JH-14～JH-17為七月菊，又稱早貢菊，可以看到七月菊與貢菊在內(nèi)成分含量上有很大區(qū)別，七月菊木犀草苷(峰3)的含量很低，但是峰11的含量卻是貢菊中峰11含量的6～8倍，且七月菊中不含有峰12。在表3中金香菊、黃菊、萬壽菊、野菊花與貢菊在內(nèi)成分含量和數(shù)量上區(qū)別也有很大的，尤其是野菊花，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其內(nèi)成分?jǐn)?shù)量比貢菊的減少了一半，而杭白菊的內(nèi)成分卻比貢菊豐富得多(圖2、3)。表4相似度結(jié)果進(jìn)一步證明：黃山貢菊質(zhì)量較為穩(wěn)定、均一，相似度大于0.96，與其他品種的菊花差異顯著，相似度均小于0.86。因此，可通過 HPLC指紋圖譜的方法有效保證黃山貢菊藥材的質(zhì)量穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，峰9在貢菊和杭白菊色譜圖中出峰清晰，峰面積可觀，但在亳菊、滁菊，祁菊、懷菊和野菊花中均未檢測(cè)到，是貢菊和杭白菊的特有成分；峰10在貢菊、杭白菊、滁菊及野菊花色譜圖中出峰明顯，但在亳菊、祁菊、懷菊中含量很低或不含，是貢菊、杭白菊及滁菊的特有成分；1,5-O-二咖啡酰基奎寧酸(峰6)在所有樣品中出峰穩(wěn)定、峰面積顯著，是菊花的特征性成分。

2010年版《中國(guó)藥典》中菊花以綠原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸為主要指標(biāo)成分，其中規(guī)定木犀草苷(峰3)的含量不得少于0.080%。從表3可知，亳菊、滁菊、懷菊和祁菊中木犀草苷峰面積非常低，有的甚至不含有。因此，以木犀草苷作為菊花的指標(biāo)性成分進(jìn)行質(zhì)量控制是否合適還值得商榷。

2010版《中國(guó)藥典》中金銀花以綠原酸和木犀草苷作為指標(biāo)成分，但金銀花中3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量非常高[11-12]。從圖3可知，如果把3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸作為菊花的指標(biāo)成分，可能會(huì)導(dǎo)致菊花和金銀花藥材的濫用、混用；而1,5-O-二咖啡酰基奎寧酸在所有菊花樣品中均含有，是菊花的特有成分，因此，可考慮將1,5-O-二咖啡酰基奎寧酸(峰6)增加作為菊花品種的指標(biāo)性成分進(jìn)行質(zhì)量控制。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典: 一部[S]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010: 192.

[2] 劉金旗, 沈其權(quán), 劉勁松, 等. 貢菊化學(xué)成分的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2001, 26(8): 547-548.

[5] 秦民堅(jiān), 龔建國(guó), 顧瑤華, 等. 黃山貢菊的揮發(fā)油成分[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào), 2003, 12(4): 54-56.

[4] 陳國(guó)平, 王靖宇. 黃山貢菊中綠原酸含量的測(cè)定[J]. 光譜儀器與分析, 2006(增刊1): 176-178.

[5] 陳國(guó)平, 王澍. 黃山貢菊提取物對(duì)羥自由基清除作用[J]. 化工時(shí)刊,2005, 19(5): 14-17.

[6] 潘正軍, 王新風(fēng), 周雪瑞. 黃山貢菊水煎劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性高血壓小鼠血壓和血脂含量的影響[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2008, 19(3): 669-670.

[7] 張鞍靈, 馬瓊, 高錦明, 等. 綠原酸及其類似物與生物活性[J]. 中草藥, 2001, 32(2): 173-176.

[8] 蔣惠娣, 胡碧波, 曾蘇. 杭白菊HPLC指紋圖譜的評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2005, 4(8): 578-581.

[9] 趙玉叢, 劉國(guó)際, 任保增, 等. 菊花的HPLC指紋圖譜研究[J]. 中草藥, 2005, 10(10): 1552-1555.

[10] 程宏英, 馮啟余, 曹玉華, 等. 菊花中活性成分的高效液相色譜測(cè)定與指紋圖譜研究[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 23(3): 257-262.

[11] 張宇平, 黃可龍. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定金銀花中5種有機(jī)酸[J].分析實(shí)驗(yàn)室, 2007, 26(7): 67-70.

[12] 庫(kù)爾班江, 蘇文琴, 張鵬威. 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2008, 19(6):1441-1442.

HPLC Fingerprinting of Huangshan Gongju Chrysanthemum (Chrysanthemum morifoliumRamat.)

ZHA Fang-fang1，GAO Xue-ling1,*，ZOU Min-liang2，HE Chang-ming2，HE Man-man1
(1. College of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；2. Healthy-Star Biotech R&D Co. Ltd., Shanghai 200335, China)

Objective: To establish the HPLC fingerprint of Huangshan Gongju chrysanthemum (Chrysanthemum morifoliumRamat.) for its quality control and evaluation. Method: A total of 28 chrysanthemum samples of different geographical origins were determined by HPLC and evaluated using the Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprints of Traditional Chinese Medicine to construct a common pattern. Results:Twelve common peaks were identified in the established fingerprints, each of which shared a similarity exceeding 0.96 with the control fingerprint and a similarity below 0.86 with other chrysanthemum varieties. Conclusion:The proposed method is simple, accurate, repeatable and suitable for quality control and evaluation of Huangshan Gongju chrysanthemum.

Huangshan Gongju chrysanthemum；high performance liquid chromatography (HPLC)； chromatographic fingerprint；similarity

TS207.3

A

1002-6630(2011)20-0146-05

2011-01-18

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2010GA710027)

査芳芳(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参镌词称焚|(zhì)量與安全。E-mail：zhafangfang0921@hotmail.com

*通信作者：高學(xué)玲(1967—)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称凤嬃霞庸ぁ-mail：shling@ahau.edu.cn