高效液相色譜法檢測熟肉制品中5種人工合成色素方法的建立

胡漢高，張紅菱,*，周 威，李靜娜，黃萬琪

(1.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.武漢市疾病預(yù)防控制中心，湖北 武漢 430015)

高效液相色譜法檢測熟肉制品中5種人工合成色素方法的建立

胡漢高1，張紅菱1,*，周 威1，李靜娜2，黃萬琪1

(1.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.武漢市疾病預(yù)防控制中心，湖北 武漢 430015)

目的：建立一種同時檢測熟肉制品中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅5種人工合成色素的方法。方法：熟肉制品經(jīng)石油醚脫脂、乙醇-氨-水(7:2:1，V/V)超聲波振蕩提取，聚酰胺粉過濾；采用Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，以0.02mol/L乙酸銨和甲醇梯度洗脫，采用二極管陣列檢測器在可變波長條件下檢測。結(jié)果：該方法線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9992～0.9999；5種人工合成色素回收率均在89.6%～96.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.24%～4.11%。結(jié)論：以高效液相色譜法同時檢測以上5種人工合成色素，靈敏度高、操作方便、快速、準(zhǔn)確度高。

熟肉制品；人工合成色素；高效液相色譜法；二極管陣列檢測器

食品著色劑可分為天然色素和人工合成色素兩大類，因人工合成色素具有成本低廉、色調(diào)多樣、色澤亮艷和著色力強(qiáng)等特點，在食品加工業(yè)中被廣泛采用。因其是由煤焦油中的苯胺為原料制成，所以又稱為“煤焦油色素”或“苯胺色素”，屬于偶氮類化合物[1]。毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，某些合成色素有慢性毒性或致癌性，使用過量會對人體產(chǎn)生有害作用[2-3]。在我國人工合成色素使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中對其使用范圍和相應(yīng)限量均有明確規(guī)定，使用范圍限于飲料、配制酒、糖果、糕點和青梅等，禁止用于肉類、魚類、水果及其制品等[4]。目前，國標(biāo)及文獻(xiàn)報道[5-15]的檢測方法多是針對這些人工合成色素中的一種或幾種，而沒有關(guān)于這5種人工合成色素在熟肉制品中同時檢測的報道，初步工作結(jié)果表明，這些色素在熟肉制品中存在一定程度的濫用，如果根據(jù)實際任務(wù)要求檢測這些色素中的一種或幾種在食品中的含量，而其中每一種都需分別進(jìn)行檢測。這樣不但增加了工作量、延長了工作時間，還降低了工作效率。所以同時檢測熟肉制品的這些色素不僅可以提高工作效率，還可以起到篩查的效果，以免漏檢。因此建立一種快速準(zhǔn)確且能夠同時測定熟肉制品中這5種人工合成色素的檢測方法，不僅能夠為基層食品檢測單位提供理論指導(dǎo)，而且能大大提高日常檢測的工作效率。本實驗采用高效液相色譜法對熟食肉制品中5種人工合成色素進(jìn)行分離檢測，得到了滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

各種熟肉制品60件為在武漢市范圍內(nèi)抽取。

1.00mg/mL檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)溶液 中國計量科學(xué)研究院；混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確吸取1mL各標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，得100μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液(4℃保存2個月)；乙醇氨水溶液；乙醇-氨-水(7:2:1，V/V)；酸化甲醇：甲醇-甲酸(6:4，V/V)；甲醇(色譜純) 美國Tedia公司；所用試劑除特別標(biāo)注外均為分析純；水均為超純水。

600E型高效液相色譜儀、2996型二極管陣列檢測器美國Waters公司；KH-600E超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；PT-310電子天平 德國賽多利斯公司；AFX2-1001-P超純水機(jī) 頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司；KDC-1042低速臺式離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；Anke TGL-16B高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 樣品處理

將樣品粉碎混合均勻，稱取10g左右(精確至0.01g)置入100mL燒杯中，加海沙少許(約10g)，混合均勻，再加入30mL石油醚，攪拌，超聲10min，放置片刻，傾出石油醚，如此重復(fù)處理3次，以除去脂肪，用80℃水浴揮盡石油醚后，殘渣轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，加入乙醇氨水溶液25mL，超聲振蕩10min，提取色素，3000r/min離心10min，上清液倒入100mL燒杯(不要用濾紙過濾)，殘渣繼續(xù)用乙醇氨水溶液提取，至提取液無明顯顏色。合并上清液于100mL燒杯中，用80℃水浴揮至10mL左右(不得揮干)，用20%檸檬酸溶液調(diào)pH值至酸性，待用。

1.3 樣品凈化

將1.2節(jié)處理后所得的溶液保持在60～80℃，加入預(yù)先用水活化過的自制聚酰胺SPE小柱。用70℃、pH4的檸檬酸溶液淋洗，每次20mL，邊洗邊攪拌，重復(fù)3～4次。再用酸化甲酸溶液淋洗至中性，然后用乙醇氨水溶液洗脫，收集全部洗脫液于100mL燒杯中，用80℃水浴揮至2mL左右(不得揮干)，用水稀釋至10mL比色管中定容至10mL刻度。12000r/min離心10min，上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，得樣品制備液，供高效液相色譜分析用。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相及梯度：A相為0.02mol/L乙酸銨溶液，B相為甲醇，0～2min，95% A→65% A；2～7min，65% A→0% A；7～10min，0% A→95% A；10.1～21min，95% A→95% A；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃，進(jìn)樣量：10μL。檢測器：二級管陣列檢測器(PDA)；波長范圍：210～60nm。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別稀釋至每毫升相當(dāng)于1.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg混合標(biāo)準(zhǔn)系列(現(xiàn)用現(xiàn)配)。將混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)、相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸。

1.6 人工合成色素含量計算

混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液與樣品制備液按照1.4節(jié)色譜條件進(jìn)行檢測，5種人工合成色素與熟肉制品中其他共存物質(zhì)分離良好，測定不受干擾。計算試樣中人工合成色素的含量。

式中：X為樣品中人工合成色素含量/(g/kg)；A為樣品測定的含量/(μg/mL)；V為樣品定容體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖及最大吸收波長

高效液相色譜與二極管陣列檢測器聯(lián)用，可繪制出隨時間(t)的變化經(jīng)過檢測器樣液的光譜吸收曲線-吸光度(A)隨波長(K)變化的曲線，因而可由獲得的信息繪制出具有三維空間的色譜圖，用二極管陣列檢測器采集5種人工合成色素在210～600nm波長范圍內(nèi)的光譜圖，得到5種人工合成色素的最大吸收波長為檸檬黃420nm、莧菜紅520nm、胭脂紅510nm、日落黃487nm、誘惑紅509nm。在1.4節(jié)色譜條件下5種人工合成色素保留時間重現(xiàn)性良好，樣品經(jīng)凈化后無明顯干擾，其標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)樣品和空白樣品在210～600nm波長范圍內(nèi)的最大值色譜圖如圖l所示。

圖1 各溶液的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of five pigment standards, sample spiked with standards and blank solution

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的確定

將混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在1.4節(jié)色譜條件下進(jìn)樣分析，以混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、其相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得以下5種人工合成色素的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)，方法的最低檢測限按3倍信噪比計算(表1)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)、檢測限Table 1 Standard curves, linearity ranges and limit of detections for five artificial pigments

2.3 精密度及加標(biāo)回收率實驗

分別稱取10.00g同一混合均勻的樣品共8份，其中兩份本底，6份分別準(zhǔn)確加入500μL 100μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液做加標(biāo)回收，按照1.2節(jié)方法操作，分別定容至10mL比色管，制備液相當(dāng)于加標(biāo)質(zhì)量濃度為5μg/mL，測定空白、加標(biāo)樣品中5種人工合成色素的質(zhì)量濃度。樣品本底為未檢出，計算加標(biāo)平均回收率，每組加標(biāo)樣品測6次，結(jié)果見表2。

表2 回收率及精密度實驗結(jié)果Table 2 Spike recoveries of five pigments and relative standard deviation of 6 repeated determinations

以上驗證實驗結(jié)果RSD值均小于5%，說明精密度良好，平均回收率也較高。所以，證明該處理方法所測得的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性良好。

2.4 熟肉制品中5種人工合成色素的檢測

按照1.2節(jié)方法測定60件熟肉制品，其中2件鹵雞爪樣品中含有檸檬黃，結(jié)果為0.063、0.052g/kg。1件鹵雞爪樣品中含有檸檬黃和日落黃，結(jié)果為0.047、0.016g/kg。1件熟制牛肉樣品中含有莧菜紅和誘惑紅，結(jié)果為0.023、0.011g/kg。1件鹵豬肉樣品中含有胭脂紅0.008g/kg。檢出率為8.33%。

3 討 論

3.1 梯度洗脫條件的選擇

為了利于色譜峰的分離，選用0.02mol/L乙酸銨溶液與甲醇進(jìn)行梯度洗脫。最初4min內(nèi)，如果甲醇體積分?jǐn)?shù)變化過快，檸檬黃和莧菜紅不能很好的分離，采用甲醇首先緩慢上升。5min后甲醇快速上升，可以使誘惑紅與其他組分既好又快分離，縮短總時間，節(jié)約流動相。該梯度使這5種色素得到很好的分離且靈敏度均有一定程度的提高。

3.2 色譜柱平衡時間的確定

采用梯度洗脫進(jìn)行測定，每次進(jìn)樣之間均需一段時間平衡。本法測定時先用8min時間平衡，5種人工合成色素的保留時間不重現(xiàn)，故將平衡時間增加至11min，5種人工合成色素的保留時間重現(xiàn)性較好。

3.3 樣品處理條件的選擇

聚酰胺粉SPE小柱為實驗室自制，聚酰胺粉SPE小柱外殼為聚乙烯塑料管內(nèi)裝聚酰胺粉，柱長6cm，直徑1cm，粉柱兩端用無色石英薄板封堵，因為小柱中聚酰胺粉的量有限，在使用時經(jīng)常會使溶液中色素穿透，所以加入聚酰胺粉的量非常關(guān)鍵，經(jīng)比較分別加入0.50、0.75、1.00g聚酰胺粉，發(fā)現(xiàn)加入0.75g聚酰胺粉能夠完全保留目標(biāo)組分，符合實驗需要，且回收率高，測得結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1.2節(jié)中色素經(jīng)提取后，提取液用水浴鍋揮干時，比較將提取液完全揮干和將提取液揮至2mL左右定容，前者定容后色素溶解不完全，嚴(yán)重影響回收率，而后者確保了良好的回收率。

3.4 測定方法的選擇

國標(biāo)方法GB/T 5009.141—2003《食品中誘惑紅的測定》為紙層析-分光光度法[16]，該標(biāo)準(zhǔn)方法步驟繁瑣復(fù)雜，檢出限為25mg/kg，靈敏度低。本方法為液相色譜法，檢出限為0.10mg/kg，靈敏度更高。而且與檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃4種常用人工合成色素同時檢測，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性良好、靈敏度高，大量節(jié)約了檢測時間和試劑成本從而提高了工作效率。為日常食品檢測工作提供了良好的指導(dǎo)意義。

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Development of an HPLC Method for Determination of Five Artifical Food Pigment in Cooked Meat Products

HU Han-gao1，ZHANG Hong-ling1,*，ZHOU Wei1，LI Jing-na2，HUANG Wan-qi1
(1. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. Wuhan Diseases Control and Prevention Center, Wuhan 430015, China)

Objective: To establish an HPLC method for simultaneous determination of five artificial pigments (lemon yellow,amaranth, carmine, sunset yellow and fancy red) in cooked meat products. Methods: Cooked meat products were defatted by petroleum ether, and extracted by ethanol/ammonia/water solution (7:2:1,V/V) with the assistance of ultrasound. The resultant extract was treated using a polyamide SPE cartridge. The pigments were separated on an Eclipse XDB-C18 column (5μm, 4.6 mm ×250 mm) by gradient elution with a mobile phases made up of 0.02 mol/L NH4Ac and methanol, and detected by a DAD detector at alterable wavelength. Results: The established method displayed good linearity with correlation coefficient between 0.9992 and 0.9999. The recoveries of the five pigments ranged between 89.6% and 96.4% with a relative standard deviation (RSD)between 1.24% and 4.11%.Conclusions: This method is sensitive, simple, rapid and accurate, and can be used for simultaneous determination of the five artificial pigments in cooked meat products.

meat products；artificial pigment；high performance liquid chromatography (HPLC)；diode array detector(DAD)

TS207.3

A

1002-6630(2011)20-0171-04

2010-12-22

胡漢高(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為衛(wèi)生檢驗。E-mail：hhg1957@163.com

*通信作者：張紅菱(1965—)，女，教授，碩士，研究方向為衛(wèi)生檢驗。E-mail：zhlwjb@sina.com