超聲波預(yù)處理微波萃取葛根總黃酮的工藝優(yōu)化

顧仁勇，朱愛華，王文熙，劉 杰，李佑稽

(吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000)

超聲波預(yù)處理微波萃取葛根總黃酮的工藝優(yōu)化

顧仁勇，朱愛華，王文熙，劉 杰，李佑稽

(吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000)

以湘西野葛根為原料，優(yōu)化葛根總黃酮超聲微波雙輔助萃取工藝。研究超聲提取溫度、超聲作用時間、微波功率、微波作用時間、固液比5個影響因素對葛根總黃酮提取量的影響，采用紫外分光光度計測定葛粉中總黃酮的含量，建立葛根總黃酮的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，在以80%的乙醇為提取溶劑、微波輻射功率300W、微波輻射時間9min、固液比1:25(g/mL)、超聲提取溫度50℃、超聲提取時間30min的條件下，總黃酮的提取量可達14.685mg/g。

葛根；總黃酮；超聲波；微波

葛根(Radix Pueraria)為豆科植物野葛的干燥根，其味甘、辛、性平，是一種既有豐富營養(yǎng)又有獨特藥理作用的藥食兩用資源[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有解肌退熱、透發(fā)麻疹、生津止渴、升陽止瀉等功效。目前，隨著現(xiàn)代食品科技與現(xiàn)代醫(yī)藥的發(fā)展，深入研究葛根黃酮成為功能食品、醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域的熱點問題[2-4]。

葛根除含有約占新鮮葛根20%～25%的高級淀粉以及豐富的人體必需氨基酸和礦物元素等營養(yǎng)成分外，還含有多種異黃酮、三萜類、芳香類及其他活性成分，具有多種藥理作用。其中，葛根中最重要的生理活性成分葛根總黃酮是一種天然的抗氧化劑，具有清除人體中過氧化氫、抗衰老和增加機體免疫力的作用[5-7]。在食品中它們應(yīng)用于功能性食品添加劑，如天然甜味劑、天然抗氧化劑、天然色素等；應(yīng)用于功能食品，如生物類黃酮口香糖、銀杏葉袋泡茶等防衰、抗癌、提高免疫力食品。在獸藥、農(nóng)藥等領(lǐng)域，現(xiàn)已開發(fā)出了一些具有特效功能的含有黃酮類化合物藥品和驅(qū)蟲、殺蟲劑等[8]。

葛根總黃酮的提取方法主要有醇回流法、浸漬法、超聲輔助萃取法、微波輔助萃取法等[9-11]。目前，工業(yè)上采用的熱浸提或乙醇加熱回流等傳統(tǒng)方法溶劑消耗量大、萃取時間長、效率比較低。近年來，超聲和微波輔助萃取技術(shù)在植物有效成分的提取方面得到了廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)的醇回流和浸漬提取法相比，超聲輔助萃取法溶劑用量較少，萃取時間較短，而微波具有穿透力強、選擇性高、加熱效率高等特點[12-14]。

本實驗以葛根為原料，以80%乙醇溶液為提取溶劑，采用超聲預(yù)處理微波萃取提取總黃酮，利用紫外可見光分光光度計測定葛根總黃酮含量，研究相關(guān)因素對其提取量的影響，并篩選出最佳的提取工藝及參數(shù)[15]。本實驗將超聲和微波兩種提取方法相結(jié)合，旨在為探索葛根黃酮的進一步開發(fā)，以及提高葛根資源的綜合利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

葛根塊 湘西州仙賜食品有限責(zé)任公司。蘆丁標準品 中國藥品生物制品鑒定所；95%乙醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

NJL07-3型實驗專用微波爐 南京杰全有限公司；DS-高速組織搗碎機 上海比朗儀器有限公司；GZX-9146MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；TMP-2上皿式電子天平 廈門欣銳儀器儀表有限公司；KQ-250型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮標準曲線繪制

精密稱取無水蘆丁對照品適量，加體積分數(shù)為75%乙醇溶液制成蘆丁質(zhì)量濃度0.2mg/mL的溶液。分別吸取該溶液2、4、6、8、10mL，置于5只50mL的容量瓶中，加蒸餾水至12mL，加質(zhì)量分數(shù)5% NaNO2溶液2mL，搖勻放置6min，加質(zhì)量分數(shù)10% Al(NO3)3溶液2mL，搖勻放置6min后，再加質(zhì)量分數(shù)4.3% NaOH溶液20mL，并加水稀釋至50mL，搖勻放置15min。將不同質(zhì)量濃度的蘆丁標準溶液在波長510nm處，以蒸餾水為空白參比，測定吸光度，并繪制黃酮質(zhì)量濃度與吸光度的標準曲線。

1.2.2 總黃酮提取工藝流程

葛根→洗凈切片→干燥→粉碎過60～120目篩→稱量→乙醇預(yù)浸→超聲處理→微波萃取→抽濾→葛根黃酮提取物

1.2.3 單因素對葛根總黃酮提取量的影響

將葛根用粉碎機粉碎，過60～120目篩，制成葛根粉。稱取葛根粉4g，按一定固液比加入體積分數(shù)80%乙醇溶液，提取溫度為50℃，預(yù)浸時間為10min，在不同的超聲溫度、超聲作用時間的條件下，然后在不同微波功率、微波作用時間、固液比的條件下，進行提取，將濾液減壓過濾，通過紫外分光光度計測定萃取液中葛根總黃酮的吸光度。

1.2.3.1 微波輻射時間對葛根總黃酮提取量的影響

選取4g過60～120目的葛根粉進行試驗。在固液比1:25(g/mL)，超聲作用時間20min，提取溫度45℃，微波輻射功率300W時分別萃取3、5、7、9、11min，通過紫外分光光度計測定萃取液中葛根總黃酮的吸光度。

1.2.3.2 超聲作用時間對葛根總黃酮提取量的影響

選取4g過60～120目的葛根粉進行試驗。按固液比為1:25加入80%乙醇溶液，在超聲提取溫度45℃條件下，分別超聲作用時間10、20、30、40、50min，再通過300W微波萃取7min，通過紫外分光光度計測定萃取液中葛根總黃酮的吸光度。

1.2.3.3 固液比對葛根總黃酮提取量的影響

選取4g過60～120目的葛根粉進行試驗。分別按為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30加入80%乙醇，在超聲作用20min，提取溫度45℃，微波輻射功率300W條件下萃取7min，通過紫外分光光度計測定萃取液中葛根總黃酮的吸光度。

1.2.3.4 超聲提取溫度對葛根總黃酮提取量的影響

選取4g過60～120目的葛根粉進行試驗。按固液比為1:25加入80%乙醇，分別在40、45、50、55、60℃條件下，超聲作用20min，再通過300W微波萃取7min，通過紫外分光光度計測定萃取液中葛根總黃酮的吸光度。

1.2.3.5 微波輻射功率對葛根總黃酮提取量的影響

選取4g過60～120目的葛根粉進行試驗。在固液比為1:25，超聲作用時間20min，提取溫度45℃，微波輻射功率200、300、400、500W時分別萃取7min，通過紫外分光光度計測定萃取液中葛根總黃酮的吸光度。

1.2.4 樣品處理與檢測

稱取4g葛根粉，經(jīng)超聲預(yù)處理微波萃取后，吸取4mL提取液于50mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至12mL，加質(zhì)量分數(shù)為5% NaNO2溶液2mL，搖勻放置6min，加質(zhì)量分數(shù)為10% Al(NO3)3溶液2mL，搖勻放置6min，加質(zhì)量分數(shù)為4.3% NaOH溶液20mL，再加水稀釋至50mL，搖勻放置15min后，測定吸光度，按照標準曲線換算樣液中總黃酮的質(zhì)量濃度，計算樣品中總黃酮的提取量。換算公式為：

式中：M為樣品中總黃酮的提取量/(mg/g)；C為總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為提取液體積/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮標準曲線方程

將實驗結(jié)果進行線性回歸得回歸方程和相關(guān)系數(shù)為：A=11.209C－0.0114(R2= 0.99956)。式中：A為吸光度；C為總黃酮的質(zhì)量濃度/(mg/mL)。結(jié)果表明，在蘆丁質(zhì)量濃度0.008～0.04mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 微波輻射時間對葛根總黃酮提取量的影響

由圖1可看出，在超聲時間、超聲溫度、微波輻射功率、固液比在一定時，微波時間越長，萃取物含量就越多，當達到9min是達到最大值。而常規(guī)萃取葛根素通常需要3～4h，從而可看出，超聲輔助微波提取可在很短的時間內(nèi)達到較好的萃取效果。

圖1 微波輻射時間對總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of microwave treatment time on extraction yield of total flavonoids

2.2.2 超聲作用時間對葛根總黃酮提取量的影響

圖2 超聲處理時間對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on extraction yield of total flavonoids

由圖2可看出，在其他一定條件下，超聲預(yù)處理時間對萃取有一定的影響，當超聲處理時間為40min時萃取效果最好。

2.2.3 固液比對葛根總黃酮提取量的影響

圖3 固液比對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

由圖3可看出，在一定條件下，不同的的固液比對萃取效果的影響很大，葛根粉與乙醇用量的最佳為1:25。

2.2.4 超聲提取溫度對葛根總黃酮提取量的影響

圖4 超聲提取溫度對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of temperature during ultrasonic treatment on extraction yield of total flavonoids

由圖4可看出，超聲預(yù)處理溫度對總黃酮的萃取有很大影響，當溫度越高，其他條件一定時，葛根總黃酮的萃取物含量越高。溫度為45℃時，效果最佳。

2.2.5 微波輻射功率對葛根總黃酮提取量的影響

圖5 微波功率對總黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of microwave power on extraction yield of total flavonoids

由圖5可看出，微波輻射功率的高低對萃取效果有顯著的影響，當超聲時間、超聲溫度、微波時間和固液比一定時，輻射功率越高，萃取物含量也隨之升高，在300W處達到最大值。

2.3 正交試驗[16-17]

參考已有的資料，每個因素選用4個水平，采用L16(45)正交試驗，正交試驗水平表如表1所示。

表1 葛根總黃酮提取正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

表2 葛根總黃酮提取正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array matrix and experimental results

對表2數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variances for extraction yield of total flavonoids with various extraction conditions

由表2、3得出各因素對實驗結(jié)果的影響都不顯著，但是各因素的影響程度不同，影響程度由大到小依次為：E＞D＞C＞A＞B?？傸S酮的最佳提取工藝條件為A2B3C2D3E3，即微波輻射功率300W、微波輻射時間9min、固液比1:25、超聲提取溫度50℃、超聲提取時間30min。

2.4 最佳工藝驗證實驗

根據(jù)正交試驗所得的最優(yōu)條件，在微波輻射功率300W、微波輻射時間9min、固液比1:25、超聲提取溫度50℃、超聲提取時間30min條件下做驗證實驗，得到總黃酮的提取量為14.685mg/g。

3 結(jié) 論

采用超聲預(yù)處理微波萃取葛根總黃酮是結(jié)合了微波對植物細胞的破壁作用、加熱作用和超聲波的空化效應(yīng)，提高了黃酮的溶出速率。結(jié)果表明，在微波輻射功率300W、微波輻射時間9min、固液比1:25、超聲提取溫度50℃、超聲提取時間30min條件下，總黃酮提取量可達14.685mg/g。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典: 一部[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2000.

[2] 胡崇琳, 劉東莉, 王蕊霞, 等. 葛根總黃酮的提取及抗氧化性能評價[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(6): 162-165.

[3] 華輝, 郭勇. 黃酮類化合物藥理研究進展[J]. 廣東藥學(xué), 1999, 9(4):9-12.

[4] 劉曉宇, 張俊杰, 王蕊霞. 葛根總黃酮的提取及抗氧化活性評價研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(10): 232-236.

[5] 唐瑜. 葛根素對腦缺血再灌注損傷保護機制的研究現(xiàn)狀[J]. 四川生理科學(xué)雜志, 2006, 28(4): 177-179.

[6] 高翔, 李濤, 高全, 等. 葛根素預(yù)處理與缺血預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J]. 貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2006, 31(6): 523-526.

[7] 龔志剛, 胡紅霞, 朱篤, 等. 葛根素對糖尿病大鼠血糖和抗氧化能力的影響[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(11): 498-501.

[8] 徐東翔. 植物資源化學(xué)[M]. 長沙: 湖南科學(xué)技術(shù)出版社, 2004: 17-21.

[9] 祝世發(fā), 陳文, 江發(fā)壽, 等. 葛根中葛根素的提取工藝研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2004, 15(3): 114-115.

[10] 王亞紅, 曲小姝, 祝波, 等. 葛根素提取及純化工藝研究現(xiàn)狀[J]. 天津化工, 2008, 22(6): 12-14.

[11] 金福, 易紅, 馮偉紅, 等. 葛根不同提取工藝的實驗研究[J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(9): 1171-1172.

[12] 孔慶新, 祝冬青. 微波輔助萃取葛根總異黃酮的工藝研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(33): 10835-10836; 10851.

[13] 王娟, 沈平嫌, 沈永嘉. 葛根中有效成分的微波輔助萃取研究[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2002, 33(8): 382-383.

[14] 張尊聽, 楊伯倫, 劉謙光, 等. 野葛根異黃酮成分的超聲萃取及抗氧化作用[J]. 食品科學(xué), 2002, 23(5): 31-33.

[15] 麻明友, 肖卓炳, 吳顯明, 等. 葛根總黃酮的超聲微波雙輔助萃取研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(24): 242-245.

[16] 謝果, 張強國. 用正交實驗優(yōu)選葛根總黃酮的提取工藝研究[J]. 重慶科技學(xué)院學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2006, 8(1): 46-48.

[17] 曾超珍, 劉志祥. 微波提取杜仲總黃酮的工藝研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2009, 20(5): 1170-1171.

Process Optimization for Extraction of Total Flavonoids from Radix Pueraria by Ultrasonic Followed by Microwave Treatment

GU Ren-yong，ZHU Ai-hua，WANG Wen-xi，LIU Jie，LI You-ji
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China)

Ultrasonic followed by microwave treatment was used to establish a novel method to extract total flavonoids from Radix Pueraria. The effects of five extractions, namely temperature during ultrasonic treatment, ultrasonic treatment time,microwave power and treatment time and solid-to-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids from Radix Pueraria were explored. The quantification of total flavonoids was conducted using a UV spectrophotometer. The results showed that the maximum yield of total flavonoids could reach 14.685 mg/g was attained by using 80% ethanol as the extraction solvent at a solidto-liquid ratio of 1:25 under the assistance of 30 min ultrasonic at 50 ℃ followed by 9 min microwave treatment at 300 W power.

Radix Pueraria；flavonoids；ultrasonic；microwave

R284.2

A

1002-6630(2011)10-0057-04

2010-08-14

顧仁勇(1972—)，男，副教授，碩士，研究方向為食品加工及保藏。E-mail：gry8565398@163.com