磁納米分子印跡聚合物的制備及性能

劉微波，陳 偉，彭池方，胥傳來*

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

磁納米分子印跡聚合物的制備及性能

劉微波，陳 偉，彭池方，胥傳來*

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

以牛血清白蛋白為模板分子，四氧化三鐵磁性納米粒子為載體，多巴胺為功能單體制備磁納米分子印跡聚合物。用制備的磁納米分子印跡聚合物吸附蛋白，并測定對蛋白的吸附容量。結果表明：隨著吸附時間的增加，吸附量增加，一段時間后可達到吸附飽和；在其他條件不變的情況下，模板濃度增加，吸附容量相應增加；印跡聚合物及其非印跡聚合物對牛血清白蛋白、人血紅蛋白和牛血紅蛋白的選擇性吸附表明所制備的磁性分子印跡聚合物對牛血清白蛋白具有特異性吸附效果。

分子印跡；磁性納米粒子；多巴胺

分子印跡技術(molecularly imprinting technique，MIT)是指制備對某一特定目標分子具有選擇性的聚合物技術，又稱分子烙印技術、分子印記技術或分子模板技術[1]。分子印跡技術作為一種分離技術，由于具有預定性、識別性、實用性三大特性，在生命科學的研究中發揮著越來越大的作用[2]。磁性納米粒子(magnetic nanoparticles，MNPs)具有無毒無害、輕便迅速的分離特點，在蛋白質和細胞分離、酶固定化等領域越來越受到關注[3]。制備具有識別生物分子功能的磁納米分子印跡聚合物，即合成Fe3O4磁性納米粒子-分子印跡聚合物核殼結構的納米粒子，可以有效地利用磁納米粒子的磁性和分子印跡的特異識別性來進行目標分子的快速磁分離。在外加磁場下，含有磁性的核殼結構分子印跡納米球，可對目標物實現快速磁分離[4-7]。磁納米分子印跡納米球復合體系在分子識別方面具有高靈敏、耐用、強記憶效應等特性，特別適合水溶液中生物分子的分離、富集，分子印跡磁性納米復合體系在生化、醫學領域具有潛在的應用前景[8-10]。

本研究先合成具有羧基表面的水溶性磁性納米粒子，然后嘗試在其表面制備分子印跡聚合物，通過不同的表征手段確定所合成的磁納米分子印跡聚合物成功后，對其性質進行測定，以期建立新型的蛋白質分離純化方法[11-12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白(BSA)、十二烷基硫酸鈉 北京拜爾迪生物公司；鹽酸多巴胺 美國Sigma公司；無水三氯化鐵 上海晶純試劑有限公司；無水乙酸鈉、三羥甲基氨基甲烷 國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250 中國醫藥集團上海化學試劑總公司；Milli-Q超純水 美國Millipore公司。

1.2 儀器與設備

100mL水熱合成反應釜 上海吉眾儀器儀表有限公司；1810-B石英自動雙重純水蒸餾器 金壇市榮華儀器制造有限公司；ZD-9556脫色搖床 金壇市盛藍儀器制造有限公司；Costar96孔8×12可拆酶標板 上海吉泰生物科技有限公司；TGL-40B臺式低速離心機 上海安亭科學儀器廠；MPMSX-5T磁性能測量系統 美國Quantum Design公司；NICOLET NEXUS 470傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 磁性納米粒子的制備

在水熱合成反應釜內加入1.39g FeCl3、1.24g CH3COONa、14mL蒸餾水，緩慢滴加l0mL 1.0mol/L的NaOH溶液，不斷攪拌，反應溫度140℃，12h后冷卻至室溫，得到黑灰色沉淀。經過濾，熱水和無水乙醇洗滌，在70℃真空干燥4h，用透射電鏡表征，得到400nm準球型多面體Fe3O4納米晶體，磁產率高于90%。

1.3.2 磁納米分子印跡聚合物的制備與表征

取4個容量瓶，1、2為實驗組，加入模板蛋白，3、4為對照組，不加入模板蛋白。在4個瓶中分別加入200μL Fe3O4磁性納米粒子(平均粒徑為400nm)，并在1、2號均加入0.5mg牛血清白蛋白(BSA)，4個瓶中都加入預先配制好的Tris緩沖液(pH8.0)，搖床振蕩2h后，各加入0.4mL鹽酸多巴胺(10mg/mL，溶解于pH8.0的Tris緩沖液)，繼續振蕩3h后，用磁鐵吸出具有磁性的部分，去除上清液，用乙酸(含0.1g/100mL SDS)振蕩洗滌5次，每次洗滌后分別用磁鐵分離去上清液，再以去離子水徹底洗滌，1、2號瓶得到的磁性沉淀物即為磁納米分子印跡聚合物。

將得到的磁納米分子印跡聚合物進行紅外掃描，制樣方法為KBr壓片法[13-15]。儀器分辨率4cm-1，掃描次數3 2次。

1.3.3 磁納米分子印跡聚合物對牛血清白蛋白的吸附

將1.3.2節所得的磁納米分子印跡聚合物各加入2mL 0.1mg/mL BSA(溶于 pH7.5、0.01g/100mL SDS Tris緩沖液)搖床振蕩2h，磁分離，考馬斯亮藍G-250測定蛋白質含量。

1.3.4 蛋白含量的分析

采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量[16-17]。考馬斯亮藍G250-蛋白質復合物呈色后，在595nm波長處吸光度與蛋白質含量呈線性關系，故可用于蛋白質濃度的測定。

取6支干凈試管，按1、2、3、4、5、6編號并加入試劑。1號試管不加標準蛋白液，加1mL蒸餾水、5mL考馬斯亮藍染液；2號試管加入0.2mL標準蛋白液、0.8mL蒸餾水、5mL考馬斯亮藍染液；3號試管加入0.4mL標準蛋白液、0.6mL蒸餾水、5mL考馬斯亮藍染液；4號試管加入0.6mL標準蛋白液、0.4mL蒸餾水、5mL考馬斯亮藍染液；5號試管加入0.8mL標準蛋白液、0.2mL蒸餾水、5mL考馬斯亮藍染液；6號試管加入1mL標準蛋白液、5mL考馬斯亮藍染液，不加蒸餾水。混勻，室溫靜置2min，以第一管為空白，于波長595nm處比色，讀取吸光度。根據標準溶液的吸光度，在坐標紙上繪制出濃度-吸光度曲線，得到的標準曲線方程為：y = 0.0069x + 0.0082(R2= 0.9941)。

樣液測定時另取一干凈試管，加入樣品1.0mL及考馬斯亮藍染液5.0mL，混勻，室溫靜置3min，于波長595nm處比色，讀取吸光度，由標準曲線方程算出未知液的蛋白質濃度。

2 結果與分析

2.1 磁性納米粒子的表征

圖1 磁性納米粒子透射電鏡圖Fig.1 TEM image of MNPs

從圖1可以清晰看出，磁性納米粒子呈粒徑均勻的球形，單分散性較好，平均粒徑在400nm左右，粒子的表面沒有包被物質，較光滑，因此可以在所合成的磁納米粒子表面制備分子印跡。

圖2 磁分離Fig.2 Magnetic separation process

從圖2磁分離的過程可以看出，所合成的磁納米粒子磁性很強，在強磁鐵的磁場作用下，分散在水溶液中的磁納米粒子液相與固相可以迅速分離，在10s左右即可以達到完全分離狀態。圖中B、C即為磁鐵放置在裝有磁納米粒子的瓶子下面和側面，都可以使磁粒子快速吸出。因此采用所合成的磁性納米粒子作為載體制備分子印跡聚合物，可以有效地利用其在磁場作用下可快速磁分離這一特征。

2.2 磁納米分子印跡聚合物的表征

圖3 磁性納米分子印跡聚合物透射電鏡圖Fig.3 TEM image of molecular imprinted MNPs

從圖3磁納米分子印跡聚合物的透射電鏡圖可以看出，經過處理的磁納米粒子外包裹了一層約20nm厚的物質，即為所制備的分子印跡，也就是實驗中所需的為了吸附BSA的空間構架。可以看出，分子印跡的制備并沒有影響磁納米粒子本身的特征，與沒有包裹的磁粒子相比，包裹一層分子印跡的磁納米粒子表面顏色較淺，但粒子分布仍然較均勻，此外，由于磁納米粒子本身粒徑較大(400nm)，包裹的分子印跡層較薄(20nm)，因此對包裹后的磁粒子在磁場中的磁響應速度影響不大，仍然可以有效利用其在磁場中的磁響應性進行目標物的磁分離。

圖4 磁納米分子印跡聚合物的紅外掃描圖Fig.4 IR image of molecularly imprinted MNPs

由Fe3O4磁性納米粒子的紅外吸收圖(圖4)可以看出，磁納米粒子表面有—COOH的存在：1624cm-1、1384cm-1處的吸收峰是C＝O和—O—的伸縮振動峰，3417cm-1處的吸收峰是O—H的伸縮振動峰，580cm-1處附近是Fe—O的特征振動峰。這些特征峰說明磁納米粒子的表面修飾上了羧基，為在其表面制備分子印跡聚合物提供了條件。曲線(b)為實驗組，即為加入模板分子的磁納米分子印跡聚合物，2922cm-1處是C—H伸縮振動，說明了—CH2—的存在；3360cm-1處，可見酚羥基的伸縮振動較弱的信號，為1241cm-1酚羥基的面內變形振動，說明了—OH的存在。曲線(a)為對照組，即為沒有加入模板的分子印跡聚合物。從圖4磁納米粒子包裹分子印跡前后的吸收峰變化可以看出，在磁納米粒子表面制備分子印跡聚合物是成功的。

2.3 模板分子含量對分子印跡粒子吸附性能的影響

各組加入200μL Fe3O4磁性納米粒子(規格為400nm)，各加入0、0.5、1、2、4mg模板BSA(分子牛血清白蛋白)，按照1.3.2節所述反應，磁分離，洗滌和吸附后以考馬斯亮藍法測定剩余測定蛋白質量，計算吸附率。

圖5 不同模板量對吸附率的影響Fig.5 Effect of template concentration on adsorption rate

由圖5可知，在變動范圍不大的情況下，隨著模板分子質量的增加，選擇性結合位點相應增多，吸附性也相應增強，吸附率增大。

吸附性取決于模板分子，功能單體以及交聯劑之間的比例。印跡分子與功能單體的用量比對分子印跡過程中識別孔穴的產生具有很大影響，對其比例的適當選擇應該依據印跡分子所含有的官能團和制備過程中所用溶劑的性質，一般而言增大功能單體的比例可以充分地預組裝印跡分子，但功能單體所占的比例并非越大越好，因為功能單體過量太多可增加由未參與組裝的功能單體所產生的非選擇性結合位點，而且過大濃度的功能單體有可能引起自身的聚合而減少選擇性結合位點數。功能單體和交聯劑的比例對MIPs的性能也有很大的影響。

2.4 分子印跡粒子的吸附容量曲線

取5組，分別加入200μL Fe3O4磁性納米粒子(400nm，10mg)，加入4mg模板BSA參照1.3.2節制備分子印跡聚合物。配制質量濃度分別為10、50、100、150、200μg/mL BSA，分別取2mL，加入分子印記聚合物進行吸附反應2h，以考馬斯亮藍法測定上清液蛋白質質量，計算吸附容量。

由圖6可以看出，隨著牛血清白蛋白初始質量濃度的增大，印跡聚合物和非印跡聚合物的吸附容量也隨之增大。在200μg/mL時，印跡聚合物吸附容量為7.8mg/g，而非印跡聚合物的吸附容量為5.4mg/g。在相同條件下印跡聚合物對模板分子的吸附容量明顯高于非印跡聚合物對模板分子的吸附容量，說明印跡聚合物具有比較強的印跡效應，對牛血清白蛋白具有較好的選擇性吸附，這是由于制備過程中使配體進行了有序排列，聚合物內部形成了形狀與官能團位置均與牛血清白蛋白相配合的空腔，正是由于這些空腔的存在，使MIP對模板物質具有良好的選擇性結合能力。

圖6 分子印跡粒子的吸附容量曲線Fig.6 Adsorption capacity curve of molecularly imprinted MNPs

2.5 分子印跡粒子的的吸附動力學實驗

200 μ L Fe3O4磁性納米粒子(規格為400nm)，加入4mg模板BSA(牛血清白蛋白)制備分子印跡聚合物，配制質量濃度為200μg/mL BSA，分別取2mL，加入分子印記聚合物進行吸附反應，在5、30、60、120min取液相，以考馬斯亮藍法剩余測定蛋白質量，計算吸附率。

圖7 分子印跡聚合物吸附動力學實驗Fig.7 Dynamic adsorption curve of molecular imprinted MNPs

圖7表明，制備的印跡聚合物具有高的吸附速度，吸附5min達到吸附容量(初始質量濃度為0.1mg/mL)的22.3%，吸附30min之后吸附率為31.5%左右，60min之后吸附基本達到平衡。當降低初始溶液的質量濃度時，將在更短的時間內內達到吸附平衡。

2.6 分子印跡粒子的選擇性分析

取3組200μL Fe3O4磁性納米粒子(平均粒徑為400nm)，分別加入4mg人血紅蛋白、牛血紅蛋白、牛血清白蛋白，作為模板，參照1.3.2節制備分子印跡聚合物，其他條件相同在5、30、60、120min取液相，以考馬斯亮藍法剩余測定蛋白質量，計算吸附率。

圖8 印跡和非印跡聚合物對人血紅蛋白(1)、牛血紅蛋白(2)、牛血清白蛋白(3)的選擇性吸附Fig.8 Selective adsorption of molecularly printed and non-printed MNPs towards human hemoglobin, bovine hemoglobin and bovine serum albumin

圖8表明，NMIP(非印跡聚合物)對3種底物的靜態分離因子相差很小，因為在它的內部沒有經過排列的選擇性結合位點，主要依靠聚合物表面非選擇性結合作用吸附底物分子，對底物無法進行有效的分離與識別。而印跡聚合物MIP對3種底物的分離因子相差相對較大，說明MIP對模板分子牛血清白蛋白有高度的選擇性和識別能力，對其他兩種底物的選擇性和識別能力則較差。

3 結 論

以牛血清白蛋白為模板分子，四氧化三鐵納米粒子為載體，多巴胺為功能單體制備磁納米分子印跡聚合物。吸附平衡曲線隨著吸附時間的增加，吸附量增加，結果一段時間后即達到吸附飽和；在其他條件不變的情況下，模板濃度增加，吸附容量相應增加；印跡聚合物及其非印跡聚合物對牛血清白蛋白、人血紅蛋白、牛血紅蛋白的選擇性吸附表明，聚合物對牛血清白蛋白具有顯著吸附效果。

[1] 陳長寶, 周杰, 吳春輝. 分子印跡技術研究進展[J]. 化學研究與應用,2006, 18(8): 86-89.

[2] JOSHI V P, KARODE S K, KULKARNI M G, et a1. Novel separation strategies based on molecularly imprinted adsor-bents[J]. Chemical Engineering Science, 1998, 53(13): 2271-2284.

[3] 賴家平, 何錫文, 郭洪聲, 等. 分子印跡技術的回顧、現狀與展望[J]. 分析化學, 2001, 29(7): 836-844.

[4] 周文輝, 林黎明, 郭秀春, 等. 三聚氰胺分子印跡聚合物的制備及奶制品中三聚氰胺的分離[J]. 分析測試學報, 2009, 28(6): 687-691.

[5] COSIMINO M, ILARIO L, PIER G Z. Molecularly imprinted electrosynthesized polymers: new materials for biomimetic sensors[J].Analytical Chemistry, 1999, 71(7): 1366-1370.

[6] LELE B S, KULKARNI M G, MASHELKAR R A. Molecularly imprinted polymer mimics of chymotrypsin: 1. Cooperative effects and substrate specificity[J]. Reactive and Functional Polymers, 1999, 39(1):37-52.

[7] 張立永, 成國祥. 分子印跡聚合物微球的制備及應用研究進展[J]. 功能高分子學報, 2002, 15(2): 214-218.

[8] ZHANG Liyong, CHENG Guoxiang, FU Cong. Molecular selectivity of tyrosine-imprinted polymers prepared by seed swelling and suspension polymerization[J]. Polymer International, 2002, 51(8): 687-692.

[9] EKBERG B, MOSBACH K. Molecular imprinting: a technique for producing specific separation materials[J]. Trends in Biotechnology,1989, 7(4): 92-96.

[10] DICKERT F I, I IEBERZEIT P, TORTSCHANOFF M. Molecular imprints as artificial antibodies-a new generation of chemical sensors[J].Sensors and Actuators, B: Chemical, 2000, 65(1): 186-189.

[11] MEDINA-CASTILLO A L, MISTLBERGER G, FERNANDEZSANCHEZ J F, et al. Novel strategy to design magnetic, molecular imprinted polymers with well-controlled structure for the application in optical sensors[J]. Macromolecules, 2010, 43(1): 55-61.

[12] TAN C J, CHUA H G, KER K H, et al. Preparation of bovine serum albumin surface-imprinted submicrometer particles with magnetic susceptibility through core-shell miniemulsion polymerization[J]. Analytical Chemistry, 2008, 80(3): 683-692.

[13] YAN Hao, ZHANG Jiancheng, YOU Chenxia, et al. Surface modification of Fe3O4nanoparticles and their magnetic properties[J]. International Journal of Minerals, Metallurgy and Materials, 2009, 16(2): 226-229.

[14] HONG Ruoyu, LI Jianhua, LI Hongzhong, et al. Synthesis of Fe3O4nanoparticles without inert gas protection used as precursors of magnetic fluids[J]. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2008, 320(9):1605-1614.

[15] WANG Zhifei, GUO Huishi, YU Yinglei, et al. Synthesis and characterization of a novel magnetic carrier with its composition of Fe3O4/carbon using hydrothermal reaction[J]. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2006, 302(2): 397-404.

[16] 馮昕, 王吉中, 堯俊英, 等. 考馬斯亮藍法測定乳與乳制品中蛋白質含量[J]. 糧食與食品工業, 2010, 7(3): 57-59.

[17] 王孝平, 邢樹禮. 考馬斯亮藍法測定蛋白含量的研究[J]. 天津化工,2009, 23(3): 40-41.

Preparation and Properties of Molecularly Imprinted Polymer Based on Magnetic Nanoparticles

LIU Wei-bo，CHEN Wei，PENG Chi-fang，XU Chuan-lai*
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

A molecular imprinted polymer was prepared using bovine serum albumin as the template molecule, iron oxide magnetic nanoparticles as the carriers and dopamine as the functional monomer. The prepared magnetic molecularly imprinted polymer nanoparticles (MNP-MIPs) were applied to adsorb protein and the protein adsorption capacity was measured. The results indicated that the adsorption capacity towards protein exhibited an increase up to the saturation level with prolonged adsorption time. Similarly, the adsorption capacity also revealed an increase trend as the template concentration rose and other conditions were kept unchanged. Moreover, bovine serum albumin could be specifically adsorbed by MNP-MIPs.

molecular imprinting；magnetic nanoparticle；dopamine

O635.2

A

1002-6630(2011)10-0061-05

2010-07-19

劉微波(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為殘留物檢測。E-mail：liuweibo@126.com

*通信作者：胥傳來(1965—)，男，教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：xcl@jiangnan.edu.cn