直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測豬肉中磺胺嘧啶

楚金申，許 楊*，何慶華，王劉花，盧 江

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047)

直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測豬肉中磺胺嘧啶

楚金申，許 楊*，何慶華，王劉花，盧 江

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047)

建立一種檢測豬肉中磺胺嘧啶的簡便、快速、高特異性的直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法。采用改良的過碘酸鈉法制備酶標(biāo)抗體，以辣根過氧化物酶催化魯米諾-過氧化氫作為化學(xué)發(fā)光體系。經(jīng)優(yōu)化該方法檢測條件為：利用檸檬酸緩沖液稀釋抗原包被質(zhì)量濃度為0.8μg/mL，酶標(biāo)抗體2000倍稀釋，競爭反應(yīng)25min；所建立的方法分析靈敏度為2.96ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù)小于8.32%，批間變異系數(shù)小于13.4%，以豬肉為樣品的分析回收率為75.6%～103.7%，與其他結(jié)構(gòu)類似物未見明顯交叉，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.9922、檢測線性范圍為4.14～244ng/mL、檢測時間為25min，可在實際生產(chǎn)中應(yīng)用。

磺胺嘧啶；直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法；辣根過氧化物酶；豬肉

磺胺類藥物是人工合成的一類具有對氨基苯磺酰胺共同母核結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物，廣泛應(yīng)用于畜禽抗感染治療，有時也作為動物飼料添加劑促進生長[1]。該類藥物的毒副作用非常明顯，據(jù)報道它與痘瘡的發(fā)病緊密相關(guān)，具有腎毒性[2]，而且可以在動物體內(nèi)殘留，通過動物源性食品進入食物鏈直接威脅人類的身體健康。磺胺嘧啶是磺胺類藥物殘留物中典型的一種[3]，其分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。我國與歐盟規(guī)定動物源性食品中磺胺類藥物總量的最高殘留限量為100μg/mL[4-5]。

圖1 磺胺嘧啶結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of sulfadiazine

目前常用的檢測磺胺嘧啶(sulfadiazine，SD)的方法主要有高效液相色譜(high performance liquidchromatography，HPLC)法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS)[7]和酶聯(lián)免疫吸附法(engyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA)[8]等。前兩種方法靈敏、準(zhǔn)確，但耗時、費力、成本高且需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)的人員操作；酶聯(lián)免疫吸附法快速、特異性好，但靈敏度不夠高。直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法省略了間接競爭方法中加二抗的步驟，節(jié)約檢測時間，既具有放射免疫法的高靈敏度，又具有酶聯(lián)免疫法操作簡便、快速的特點，線性范圍寬、測試中無需使用對人體有害的試劑[9]。

本研究制備抗磺胺嘧啶酶標(biāo)抗體，建立直接競爭酶聯(lián)免疫分析法(direct competitive-engyme-linked immunosorbent assay，DC-ELISA)，并采用魯米諾化學(xué)發(fā)光體系建立直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法(direct competitive chemiluminescence enzyme immunoassay，DC-CLEIA)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

豬肌肉 市購。

磺胺嘧啶單克隆抗體腹水 自制；磺胺嘧啶(sulfadiazine，SD)、磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine，SM2)、磺胺對甲氧嘧啶(sulfamethoxydiazine，SMD)、磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine，SMM)、磺胺甲噁唑(s u l f a m e t h o x a z o l e，S M Z)、磺胺喹惡啉(sulfaquinoxaline，SQ)、對氨基苯甲酸(4-aminobenzoic acid，PABA)、磺胺甲二唑(sulfamethizole，SMT)、磺胺吡啶(sulphapyridine，SP)、慶大霉素(gentamicin，GTM)、氯霉素(chloramphenicol，CAP) 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；磺胺(sulfanilamide，SN)、對氨基苯磺酸(sulfanilic acid，p-ASA) 阿拉丁試劑(上海)有限公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)(RZ＞3)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；化學(xué)發(fā)光底物液美國Pierce公司。

化學(xué)發(fā)光檢測儀、酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；96孔化學(xué)發(fā)光板條 深圳金燦華有限公司；Ultrospec紫外分光光度計 美國Amersham公司。

1.2 方法

1.2.1 抗體的純化及鑒定

采用辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀法[10]對腹水進行初步純化。采用Protein G親和層析柱進一步純化后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定其純度，稀釋n倍，紫外分光光度計分別測定OD280nm和OD260nm，根據(jù)式(1)計算IgG含量：

1.2.2 酶標(biāo)抗體的制備

采用改良的過碘酸鈉法[11]將HRP與已純化的單抗相連制備酶標(biāo)抗體IgG-HRP。用紫外分光光度計分別測定OD403nm和OD280nm，根據(jù)公式計算酶量、抗體量和克分子比：

1.2.3 直接競爭酶聯(lián)免疫分析法(DC-ELISA)

用0.05mol/mL磷酸緩沖液稀釋檢測抗原(SD-OVA)至1.2μg/mL，向微孔板中每孔加100μL，4℃過夜包被，PBST洗滌液洗3次，每孔加300μL封閉液(5%的脫脂牛奶)，37℃封閉1h后，甩去封閉液洗滌3次，在吸水紙上拍干，每孔中分別加入SD標(biāo)準(zhǔn)品或樣品50μL，酶標(biāo)抗體溶液50μL，混勻，37℃溫育35min，洗滌4次，拍干，加100μL TMB顯色液，顯色反應(yīng)5min后加 2mol/L硫酸50μL終止反應(yīng)，并于450nm波長處檢測光密度(OD450nm)。未加SD標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD450nm值為B0，添加了SD標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD450nm值為B，按式(2)計算結(jié)合率，結(jié)合率為50%時所對應(yīng)的SD標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度即是IC50。

1.2.4 直接競爭化學(xué)發(fā)光免疫法(DC-CLEIA)

用0.06mol/mL檸檬酸緩沖液稀釋檢測抗原(SD-OVA)至0.8μg/mL向微孔板中每孔加100μL，4℃過夜包被，然后用PBST洗滌液洗3次，每孔加300μL封閉液(5%的脫脂牛奶)，37℃封閉1h后，甩棄封閉液洗滌3次，在吸水紙上拍干，每孔中加入SD標(biāo)準(zhǔn)品或樣品50μL，酶標(biāo)抗體溶液50μL，混勻，37℃溫育25min，洗滌4次，拍干，每孔加發(fā)光底物液100μL，用化學(xué)發(fā)光檢測儀測量相對發(fā)光強度單位(relative light units，RLU)。未加SD標(biāo)準(zhǔn)品孔的RLU值為B0，添加了SD標(biāo)準(zhǔn)品孔的RLU值為B，IC50的計算同1.2.3節(jié)。

1.2.5 檢測條件的確定

采用方陣滴定[12]確定DC-ELISA抗原和抗體反應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

文獻(xiàn)[13]表明，RLUmax/IC50越大，DC-CLEIA的靈敏度和重復(fù)性越好，因此引入RLUmax/IC50評價各種因素的影響。按照1.2.4節(jié)方法分別對抗原包被液及包被質(zhì)量濃度、酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)和競爭反應(yīng)時間優(yōu)化。

1.2.6 樣品提取

參照國家標(biāo)準(zhǔn)[15]。HPLC方法的樣品提取參照測定標(biāo)準(zhǔn)[14]。

1.2.7 方法學(xué)分析

標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取4mg SD標(biāo)準(zhǔn)品溶于1mL 蒸餾水配制成4mg/mL SD標(biāo)準(zhǔn)品母液，將SD標(biāo)準(zhǔn)品母液分別稀釋至終質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200、500ng/mL，參照文獻(xiàn)[12]的方法建立DC-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照文獻(xiàn)[13]的方法建立DC-CLEIA 標(biāo)準(zhǔn)曲線。將SD標(biāo)準(zhǔn)品母液分別稀釋至終質(zhì)量濃度為10、25、50、100、200、400、800、2000、4000ng/mL，參照文獻(xiàn)[14]用HPLC分別測定計算峰面積，并建立HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。

靈敏度：對零標(biāo)準(zhǔn)點平行測定10次，計算發(fā)光或OD450nm平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差，再由平均值減去兩倍標(biāo)準(zhǔn)偏差后的值代入校準(zhǔn)曲線所求得的質(zhì)量濃度即是靈敏度，重復(fù)實驗3次，計算平均靈敏度。HPLC方法的靈敏度為以色譜峰面積響應(yīng)值等于3倍信噪比的進樣量計算，求出靈敏度。

批內(nèi)批間變異：隨機抽取板條分別進行3個批次的包被，每批次6個平行進行測定，分別計算IC50的批內(nèi)及批間變異。

回收率：在經(jīng)HPLC檢測為陰性豬肉樣品中分別添加 40、80、120μg/kg的SD標(biāo)準(zhǔn)品，依照1.2.6節(jié)進行樣品提取，分別用DC-ELISA和DC-CLEIA檢測樣品質(zhì)量濃度。

特異性：本研究選取與SD結(jié)構(gòu)類似的6種磺胺類藥物和其他兩種常見的獸藥——磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺對甲氧嘧啶(SMD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺喹惡啉(SQ)、對氨基苯甲酸(PABA)、氯霉素(CAP)和慶大霉素(GTM)，采用DC-ELISA與DCCLEIA兩種方法分別測定與SD的交叉反應(yīng)率，交叉反應(yīng)率按式(3)計算：

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體的純化與鑒定

圖2 抗體純化SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of purified anti-SD McAb

腹水經(jīng)純化后通過SDS-PAGE檢測純度，結(jié)果如圖2所示。未純化的抗體雜蛋白帶較多，使用辛酸-硫酸銨沉淀法提取純化的抗體仍然有一些雜質(zhì)蛋白，而經(jīng)過Protein G親和層析柱純化的抗體IgG有兩條清晰的條帶：一條為輕鏈，約25kD；另一條為重鏈，約50kD，純度較好。

2.2 酶標(biāo)抗體的制備

采用改良的過碘酸鈉法將制備好的單抗和HRP連接制備酶標(biāo)抗體IgG-HRP，調(diào)整HRP/IgG物質(zhì)的量投料比為1:1、2:1、4:1獲得3組酶標(biāo)抗體，經(jīng)計算得它們的HRP/IgG克分子比分別為1.04、1.22、0.84，它們的效價如圖3所示。

圖3 不同HRP/IgG物質(zhì)的量投料比酶標(biāo)抗體的效價Fig.3 The titers of IgG-HRP at different HRP/IgG molecular ratios

由圖3可知，HRP/IgG物質(zhì)的量投料比為2:1時效價最高，達(dá)到1:25600以上。

2.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析法的建立

2.3.1 抗原包被液的選擇

分別使用磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液及碳酸緩沖液稀釋抗原至0.8μg/mL進行包被，其他步驟參照1.2.4節(jié)，實驗結(jié)果如圖4所示。經(jīng)計算用3種緩沖液包被時IC50分別為53.5、36.6、37.8ng/mL，可見，檸檬酸緩沖液包被時，標(biāo)準(zhǔn)品競爭抑制效果最好，因此選擇檸檬酸緩沖液作為包被緩沖液。

圖4 抗原稀釋液的選擇Fig.4 Screening of optimum dilution buffer for coating antibody

2.3.2 抗原包被質(zhì)量濃度的選擇

采用檸檬酸緩沖液分別稀釋抗原至1.2、1.0、0.8、0.6μg/mL，其他步驟參照1.2.4節(jié)，結(jié)果如圖5所示。IC50隨著抗原包被質(zhì)量濃度的增大而增大，RLUmax/IC50隨著抗原質(zhì)量濃度的增大先是增大然后減小，在抗原質(zhì)量濃度為0.8μg/mL時達(dá)到最大，因此選用0.8μg/mL作為抗原包被質(zhì)量濃度。

圖5 DC-CLEIA抗原包被質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig.5 Screening of optimum coating antibody concentration

2.3.3 酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)的選擇

用磷酸緩沖液將酶標(biāo)抗體分別稀釋1000、1500、2000、3000倍，其他步驟參照1.2.4節(jié)，結(jié)果如圖6所示。隨著酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)的增大，IC50逐漸減小并趨于恒定，RLUmax/IC50也逐漸減小。綜合考慮IC50與RLUmax/IC50，將酶標(biāo)抗體的稀釋倍數(shù)定為2000倍。

圖6 DC-CLEIA酶標(biāo)抗體稀釋度的優(yōu)化Fig.6 Screening of optimum IgG-HRP concentration

2.3.4 酶標(biāo)抗體競爭反應(yīng)時間的選擇

圖7 DC-CLEIA抗原包被質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig.7 Screening of optimum reaction time

按照1.2.4節(jié)操作步驟分別選擇競爭反應(yīng)時間為10、15、20、25、30、35min進行實驗，結(jié)果如圖7所示。隨著溫育時間的延長，IC50呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，RLUmax/IC50在25min時達(dá)到最大，選定25min作為競爭反應(yīng)時間。

2.4 DC-ELISA與DC-CLEIA的方法學(xué)評價

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用方陣滴定法確定最佳抗原包被質(zhì)量濃度為1.2 μg/mL，酶標(biāo)抗體的稀釋倍數(shù)為1:3200，建立DC-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為Y=－15.1829lnX+117.31(R2=0.9982)，IC50=84.21ng/mL，檢測范圍(IC20～I(xiàn)C80)為11.67～607.4ng/mL。

按照1.2.7節(jié)繪制DC-CLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖8。線性回歸方程為Y=－14.717lnX+100.94(R2=0.9922)，IC50=31.87ng/mL，檢測范圍(IC20～I(xiàn)C80)為 4.14～244.6ng/mL。

圖8 DC-CLEIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard calibration curve of the DC-CLEIA

2.4.2 靈敏度和精密度

按照1.2.7節(jié)計算的DC-ELISA平均靈敏度為8.41ng/mL，DC-CLEIA平均靈敏度為2.96ng/mL，較DC-ELISA提高了2.84倍。

按照1.2.7節(jié)分別計算IC50的批內(nèi)及批間變異，結(jié)果見表1。

表1 兩種檢測方法對SD測定的精密度(n=6)Table 1 Precision of DC-CLEIA and DC-ELISA (n=6)

2.4.3 回收率

1.2.7節(jié)的回收率檢測實驗結(jié)果見表2。與DC-ELISA相比，DC-CLEIA的加標(biāo)回收率較高。

表2 兩種檢測方法對SD測定的加標(biāo)回收率(n=3)Table 2 Recoveries of SD from spiked blank pork (n=3)

2.4.4 特異性實驗

本研究選取與SD標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)構(gòu)類似的6種磺胺類藥物和其他兩種常見的獸藥——磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺對甲氧嘧啶(SMD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺喹惡啉(SQ)、對氨基苯甲酸(PABA)、氯霉素(CAP)和慶大霉素(GTM)，采用DC-ELISA與DCCLEIA兩種方法分別測定與SD的交叉反應(yīng)率，結(jié)果(表3)未見有交叉反應(yīng)。

表3 DC-ELISA與DC-CLEIA兩種方法的交叉反應(yīng)率Table 3 Cross-reactivities to SD analogues analyzed by DC-ELISA or DC-CLEIA

2.5 DC-CLEIA樣品測定與HPLC的比較

按照1.2.7節(jié)中方法進行HPLC測定發(fā)現(xiàn)，在10～4000μg/kg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=0.063X－0.048，線性相關(guān)系數(shù)為0.999，靈敏度為10 μg/kg。與DC-CLEIA方法相比，線性范圍較寬，但靈敏度較大。

分別采用DC-CLEIA和HPLC測定市場上隨機購買的26份豬肌肉樣品，兩種方法的所測結(jié)果見表4，以DC-CLEIA的測定值為X軸、HPLC測定值為Y軸作圖得相關(guān)曲線如圖9所示，線性擬合的方程為Y=0.7498X－3.788，相關(guān)系數(shù)為0.956。

表4 DC-CLEIA和HPLC的樣品測定結(jié)果Table 4 SD concentrations in real samples analyzed by DC-ELISA and DC-CLEIA

圖9 DC-CLEIA的測定值與HPLC測定值的相關(guān)性Fig.9 Correlation between DC-CLEIA and HPLC results

3 結(jié) 論

3.1 采用Protein G親和層析柱對腹水進行純化，得到純度比較高的單抗，通過改良的過碘酸鈉法制備了酶標(biāo)抗體，抗體效價達(dá)到 1:25600。

3.2 優(yōu)化了化學(xué)發(fā)光酶免疫反應(yīng)的各種條件，采用HRP催化魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系，建立了一種測定豬肉中SD化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，方法分析靈敏度為2.96ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù)小于8.32%，批間變異系數(shù)小于13.4%，以豬肉為樣品的分析回收率為75.6%～103.7%，與其他結(jié)構(gòu)類似物未見明顯交叉，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.9922，檢測線性范圍為4.14～244ng/mL，樣品檢測時間僅為25min。

3.3 建立的DC-CLEIA與DC-ELISA相比靈敏度提高了2.84倍。采用DC-CLEIA和HPLC測定了26份市場樣品，并進行對照，兩者的線性相關(guān)系數(shù)為0.956。

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Determination of Sulfadianzine Residues in Pork by Direct Competitive Chemiluminescence Enzyme Immunoassay

CHU Jin-shen，XU Yang*，HE Qing-hua，WANG Liu-hua，LU Jiang
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Sino-Germany Joint Research Institute, Nanchang University,Nanchang 330047, China)

A direct competitive chemiluminescence enzyme immunoassay (DC-CLEIA) was developed to determine sulfadiazine (SD) residues in pork. Assay parameters including coating antigen (OVA-SD) and enzyme labeled antibody concentrations concentrations and reaction time were optimized to be 0.8 μg/mL, 2000-fold dilution and 25 min, respectively. The analytical sensitivity of the developed method was 2.96 ng/mL, and the intra-assay and inter-assay coefficients of variation were below 8.32% and 13.4%, respectively. The recoveries for SD in negative pork spiked at three levels ranged from 75.6% to 103.7%. The McAb had no noticeable cross-reactivity to SD analogues. The standard curve displayed good linearity over the range of 4.14 to 244 ng/mL with a correlation coefficient of 0.9922. This DC-CLEIA may be used for routine detection and monitoring of SD in pork.

sulfadiazine；direct competitive chemiluminescence enzyme immunoassay；horseradish peroxidase；pork

TS207.3

A

1002-6630(2011)10-0124-06

2010-07-23

江西省科技支撐計劃項目(2007BS12501)；國家“863”計劃項目(2007AA10Z427)

楚金申(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為工業(yè)微生物。E-mail：chujinshen@126.com

*通信作者：許楊(1951—)，女，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：xuyang1951@163.com