南美白對蝦中4種病原菌的多重PCR檢測

郭倩倩，陶 妍*，謝 晶

(上海海洋大學食品學院，上海 201306)

南美白對蝦中4種病原菌的多重PCR檢測

郭倩倩，陶 妍*，謝 晶

(上海海洋大學食品學院，上海 201306)

根據沙門氏菌的侵染上皮細胞表面蛋白基因(invA)、單增李斯特菌的侵入關聯蛋白基因(iap)、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)和副溶血性弧菌的耐熱直接溶血素基因(tdh)分別設計4對特異性引物，并以細菌16S rRNA基因的部分保守序列為內標，通過對退火溫度、引物濃度等反應參數的調整和優化，建立的多重PCR方法為10×PCR buffer 2.0μL(含Mg2+)、dNTP 200μmol/L、DNA模板1μL、Taq DNA聚合酶2.5U，引物濃度分別為16S rRNA 200nmol/L、tdh 250nmol/L、nuc 300nmol/L、iap 350nmol/L、invA 250nmol/L，加無菌水至總體積為20 μL；反應條件：94℃預變性4min、94℃變性30s、57℃退火40s、72℃延伸1min、72℃延伸10min，反應共進行30個循環。為檢驗該方法的可行性，進一步對人工接種上述4種病原菌的南美白對蝦進行多重PCR檢測。結果表明：對污染樣品直接提取DNA和預增菌后提取DNA再進行多重PCR檢測，均能有效擴增出各個目的片段；但預增菌處理后可使檢測限明顯降低，進而大大提高檢測的靈敏度。本多重PCR方法可作為食品包括水產品中病原微生物的快速、靈敏和高效的檢測方法。

多重PCR；沙門氏菌；單增李斯特菌；金黃色葡萄球菌；副溶血性弧菌

眾所周知，傳統的微生物鑒定方法需分離培養、生化反應和血清學鑒定等多個步驟，操作復雜、周期長，不利于病原菌的快速檢測。近十年來，生物技術的發展為建立新型、快速、靈敏的病原微生物檢測方法提供了可能。例如，聚合酶鏈式反應，即P C R(polymerase chain reaction)技術，它是一種對特定DNA片段在體外進行快速擴增的技術。自1988年Chamberlian等[1]首次提出這一概念以來，該技術已被逐步應用于核酸診斷的多個領域，特別是病原微生物的檢測方面。國內許一平等[2]報道了對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測方法，但未用于實際樣品的測定；曾海燕等[3]建立了三重PCR體系用于鑒別消毒奶及其加工環境中的李斯特菌屬的幾種菌；2009年，遇曉杰等[4]報道了對生畜禽肉中沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和蠟樣芽胞桿菌進行多重PCR檢測的方法。國外Jofre等[5]報道了應用多重PCR技術同時檢測火腿腸中的單增李斯特菌和沙門氏菌；Germini等[6]對雞蛋中的大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌和單增李斯特菌進行了多重PCR檢測。

水產品因其含水量高、營養成分豐富，易受多種微生物污染，致使其檢測背景復雜，故迄今為止，關于多重PCR技術應用于水產品中病原微生物檢測的報道較少。近來，報道了對文蛤(Meretrix meretrix)中副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的三重PCR檢測方法[7]，但未考察樣品前處理方法對檢測結果的影響。本實驗在上述研究的基礎上，以沙門氏菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌表達的特異性蛋白的編碼基因為基礎，設計4對特異性引物，以16S rRNA基因為內標，建立多重PCR的優化方法；并以人工接種這些病原菌的南美白對蝦(Penaeus vannamei)為檢測對象，對其應用效果進行評價；另外，比較被檢樣品未增菌和預增菌處理后對檢測靈敏度的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

共6株實驗菌，其中金黃色葡萄球菌購自上海市工業微生物研究所；沙門氏菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)為本實驗室保藏的菌種；前4種菌為試驗菌，后兩種菌在引物特異性考察時使用。

營養肉湯培養基、細菌DNA提取試劑盒、PCR試劑、DNA Marker、6×Loadding Buffer、瓊脂糖等由天根生化科技有限公司提供。

1.2 細菌總DNA提取和引物設計

將上述6個菌種分別接種于營養肉湯中，37℃搖床培養過夜；離心收集菌體后，采用細菌DNA提取試劑盒對各種菌的基因組DNA進行提取。

分別根據沙門氏菌的侵染上皮細胞表面蛋白基因(invA)、單增李斯特菌的侵入關聯蛋白基因(iap)、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)、副溶血性弧菌的耐熱直接溶血素基因(tdh)設計4對特異性引物，以細菌16S rRNA基因的部分保守序列為內標(表1)。

1.3 引物特異性的考察

為考察所設計的引物是否準確和具特異性，先分別以沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的基因組DNA為模板，進行單重PCR擴增，反應體系為：10×PCR buffer 2.0μL(含Mg2+)、2.5mmol/L dNTP 1.6μL、DNA模板1μL、10μmol/L的上下游引物各0.5μL；Taq DNA聚合酶0.5μL，加無菌水至總體積20μL。反應條件：94℃預變性4min、94℃變性30s、57℃退火40s、72℃延伸1min、72℃延伸10min，反應共進行30個循環。然后，以6種菌基因組DNA的混合物為模板，分別使用上述與每種試驗菌相關的一對引物進行單重PCR，以期考察所設計引物的特異性。

1.4 多重PCR體系的優化

將4種試驗菌的基因組DNA混合物作為模板，使用相應的4對引物進行多重PCR。先采用如下的PCR體系：10×PCR buffer 2.0μL(含Mg2+)、2.5mmol/L dNTP 1.6μL、DNA模板1μL、10μmol/L的各種試驗菌上下游引物0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，加無菌水至總體積20μL。反應條件：94℃預變性4min、94℃變性30s、57℃退火40s、72℃延伸1min、72℃延伸10min，反應共進行30個循環。在上述反應體系和條件下，分別對退火溫度、引物濃度、DNA模板濃度等因素進行優化。

表1 引物名稱及序列Table 1 Names and sequences of primers

1.5 人工污染樣品的制備及PCR檢測

市售新鮮的南美白對蝦在無菌條件下剝殼、均質后，用作菌污染的對象。將沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌分別接種于營養肉湯中，37℃搖床培養過夜；取1mL菌液與9mL的生理鹽水混勻，10倍倍比稀釋，進行平板計數，按下列方法操作：

①每種試驗菌取108～103CFU/mL共6個濃度，每個濃度的菌液取1mL接種至含10g碎蝦肉的90mL生理鹽水或營養肉湯中，立即提取DNA或37℃搖床培養16h后提取DNA進行PCR檢測。

②將4種試驗菌的濃度分別調至108CFU/mL，混合均勻后，按10倍倍比稀釋至108～103CFU/mL，每個濃度的混合菌液取1mL接種至含10g碎蝦肉的90mL生理鹽水或營養肉湯中，立即提取DNA或37℃搖床培養16h后提取DNA進行PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 引物特異性的考察

圖1 4種試驗菌的單重PCR結果Fig.1 Singleplex PCR detection results of 4 pathogens

如圖1所示，先分別以各個試驗菌的基因組DNA為模板，加入各自的特異性引物進行PCR擴增，分別獲得來自沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的984、763、484bp和202bp的特異性譜帶，其分子大小均符合各個毒素蛋白編碼基因的預期擴增結果。

將4種試驗菌及大腸桿菌O157:H7和蠟樣芽孢桿菌的基因組DNA等量混合后作為模板，分別加入來自沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的各對引物，進行單重PCR，結果如圖2所示，各對引物只能擴增出一個片段，證明所設計的引物具有很好的特異性。

圖2 引物特異性的考察結果Fig.2 Specificity of the primers designed

2.2 多重PCR體系的優化

首先，以各個試驗菌的基因組DNA為模板，分別加入相同濃度的各對特異性引物和16S rRNA引物，進行二重PCR，分別成功擴增到預期分子大小的各個特異性片段和內標16S rRNA的95bp的片段(圖3，泳道2～5)；然后，以4種試驗菌的混合DNA為模板，對各對引物濃度進行調整后，進行多重PCR，結果顯示4種試驗菌及16S rRNA的目的片段均得到有效擴增(圖3，泳道1)。

圖3 4種試驗菌的二重及多重PCR結果Fig.3 Detection of 4 pathogens by diplex and multiplex PCR

影響多重PCR的因素較多，且每個因素對PCR的影響程度不同，本實驗主要對退火溫度、引物濃度及其他因素諸如dNTP濃度、緩沖液用量、模板濃度和延伸時間等進行篩選和優化。由于退火溫度對PCR的影響最大，首先加入等量各對引物，在其他條件不變的情況下，分別采用55～59℃的退火溫度進行多重PCR，結果如圖4所示。在退火溫度為56、57、58℃時，來自4個試驗菌和一個內標的共5個目的片段均得到有效的擴增；因為在后續的實驗中發現，57℃的擴增穩定性要高于56℃和58℃，因此選擇57℃為最佳退火溫度。在57℃的退火溫度時，其他條件不變，根據譜帶的明暗程度，分別增加或者減小各對引物的濃度，使各個目的片段達到最佳的擴增效果。由圖5A可見，泳道2和3的各個譜帶顯示了最佳的擴增效果，最終確定各對引物的濃度分別為16S rRNA 200nmol/L、tdh 250nmol/L、nuc 300nmol/L、iap 350nmol/L、invA 250nmol/L。此外，在對其他因素的優化過程中，發現dNTP濃度、模板濃度和延伸時間等對PCR結果均沒有明顯的影響，僅緩沖液用量顯示2.0μL較其他用量具有更好的擴增效果(圖 5B)。

圖4 不同退火溫度條件下的多重PCR結果Fig.4 Multiplex PCR detection at different annealing temperatures

圖5 引物濃度(A)和緩沖液用量(B)的優化結果Fig.5 Optimization of primer concentration (A) and buffer quantity (B)

2.3 對人工接種病原菌的南美白對蝦的檢測

2.3.1 單重PCR檢測

圖6 未經預增菌條件下南美白對蝦中沙門氏菌(A)和副溶血性弧菌(B)的單重PCR檢測結果Fig.6 Singleplex PCR detection of non-enriched Penaeus vannamei sample inoculated with Salmonella (A) and V.parahaemolyticus (B)

圖7 預增菌條件下南美白對蝦中沙門氏菌(A)和副溶血性弧菌(B)的單重PCR檢測結果Fig.7 Singleplex PCR detection of enriched Penaeus vannamei sample inoculated with Salmonella (A) and V. parahaemolyticus (B)

首先，采用各個單一試驗菌接種10g碎蝦肉后，直接提取污染樣品的基因組DNA進行單重PCR檢測，結果顯示，各個菌的最低檢測限分別為沙門氏菌102CFU/mL(圖6A)、副溶血性弧菌103CFU/mL(圖6B)；單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌均為103CFU/mL(結果未顯示)；另一方面，對人工接種病原菌的樣品，經過16h預增菌后再提取基因組DNA進行單重PCR檢測，結果顯示，沙門氏菌(圖7A)和副溶血性弧菌(圖7B)的最低檢測限均為101CFU/mL；單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌亦均為101CFU/mL(結果未顯示)，證明對被檢樣品進行預增菌可明顯降低檢測限。

2.3.2 多重PCR檢測

首先，將同濃度的4種試驗菌混合均勻后，稀釋至各個濃度梯度，接種10g碎蝦肉后直接提取污染樣品的基因組DNA，采用上述優化的方法進行多重PCR檢測，檢測限為104CFU/mL(圖8A)；另一方面，對接種后的樣品經過16h預增菌后再提取基因組DNA進行多重PCR檢測，檢測限明顯下降至101CFU/mL(圖8B)。

圖8 未經預增菌(A)和預增菌(B)條件下南美白對蝦中4種病原菌的多重PCR檢測結果Fig.8 Multiplex PCR detection of non-enriched (A) and enriched (B)Penaeus vannamei samples inoculated with four pathogens

3 結 論

本實驗以沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌各自特異表達的毒素蛋白的編碼基因為檢測目標，設計和篩選了對應于各個毒素蛋白的特異性引物，并確保了各對引物所擴增的片段在分子大小之間的差異，以便于多重PCR檢測；另外，16S rRNA基因在本實驗中作為一個內標，對PCR系統和反應條件的分析和判斷具有非常重要的作用，通過16S rRNA基因的擴增結果，可以對本實驗設置的不同反應條件下PCR結果之間的差異進行準確的分析和判斷。根據文獻[8]報道，在多重PCR中一個片段的擴增會對另一個片段的擴增產生抑止作用，據此，通過調整各對引物之間的濃度差異，使多重PCR結果得到有效的改善。多重PCR中另一個難點是在同時使用多對引物時退火溫度之間的差異，本實驗在對設計的多對引物進行反復篩選后，最后確定在57℃時，使用4對引物及內標引物均能有效地擴增到各自的目的片段。本實驗中緩沖液用量對PCR結果也有一定的影響，而dNTP濃度和模板濃度等影響很小，這些結果與張學敏等[9]的報道是一致的。

在建立多重PCR優化方法的基礎上，以人工接種病原菌的南美白對蝦為檢測對象，考察了直接檢測與預增菌后檢測的效果。為獲得明確和明顯的結果，采用了16h的預增菌處理時間。結果表明：16h預增菌后，能顯著降低多重PCR的檢測限，與Amagliani等[10]的研究結果一致；另一方面，無論在預增菌前接種的菌液濃度如何，在預增菌后，最終的檢測限均能達到101CFU/mL，證明食品中病原菌的生長與侵入菌的數量關系不大，而與生長的時間有密切的關系。此外，由于副溶血性弧菌的生長條件比較特殊，用普通肉湯培養基不能使其與其他3種菌同時富集生長，所以采用分別培養的方法可以達到較好的增菌效果。進一步的研究工作將聚焦于熒光定量PCR技術用于水產品致病菌的檢測及不同預增菌處理時間對多重PCR檢測靈敏度的影響方面。

[1] CHAMBERLAIN J S, GIBBS R A, RANIER J E, et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification[J]. Nucleic Acids Research, 1988, 16(23): 11141-11156.

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Detection of Four Pathogens in Penaeus vannamei by Multiplex PCR

GUO Qian-qian，TAO Yan*，XIE Jing
(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

A multiplex PCR method was presented to detect Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Vibrio parahaemolyticus from Penaeus vannamei, which are main food-borne pathogens. Specific primers were designed according to the invasion protein A gene (invA), invasion associated protein gene (iap), thermo-stable nuclease gene (nuc) and thermo-stable direct hemolysin gene (tdh) from Salmonella, L. monocytogenes, S. aureus and V. parahaemolyticus, respectively. A fragment of conserved sequence of 16S rRNA gene was used as the internal control of amplifiable bacterial DNA. The optimal PCR reaction system was identified as a 20-μL mixture composed of 10 × PCR buffer (+Mg2+) 2.0 μL, dNTP 200 μmol/L, DNA template 1 μ L and Taq DNA polymerase 2.5 U, with primer concentrations of 200 nmol/L for 16S rRNA, 250 nmol/L for tdh, 300 nmol/L for nuc, 350 nmol/L for iap and 250 nmol/L for invA, respectively. One reaction cycle consisted of denaturation at 94 ℃ for 30 s, annealing at 57 ℃for 40 s, and extension at 72 ℃ for 1 min followed by 10 min, and this cycle was repeated 30 times.The method was validated using Penaeus vannamei artificially inoculated with tested pathogens. The results showed that various target DNA fragments could be amplified by the multiplex PCR method in both non-enriched and pre-enriched samples. However, the detection sensitivity was significantly increased by enrichment at 37 ℃. Thus, the multiplex PCR method developed in this study offers an efficient and rapid way for highly sensitive detection of pathogens in aquatic food products.

multiplex PCR；Salmonella；Listeria monocytogenes；Staphylococcus aureus；Vibrio parahaemolyticus

TS201.6

A

1002-6630(2011)10-0148-05

2010-07-11

上海市科委2008年度重點科技項目(08391911500)；2009年上海市優秀學科帶頭人計劃項目(09XD1402000)；上海市教育委員會重點學科建設項目(J50704)

郭倩倩(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：guoqianguo@163.com

*通信作者：陶妍(1961—)，女，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：ytao@shou.edu.cn