新霉素的直接競爭酶聯(lián)免疫分析法

徐乃豐，胥傳來，匡 華，屈昌龍，許 陽，彭池方*

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

新霉素的直接競爭酶聯(lián)免疫分析法

徐乃豐，胥傳來，匡 華，屈昌龍，許 陽，彭池方*

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

首先用碳二亞胺(EDC)法將新霉素(NEO)偶聯(lián)于載體蛋白-卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)，合成包被原OVANEO，SDS-PAGE 進行鑒定；用高碘酸鈉法連接辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，制備酶標抗原NEO-HRP并建立直接ELISA檢測方法。通過一系列參數(shù)的優(yōu)化，包括包被溶液、封閉溶液、競爭時間、抗體稀釋液、pH值、反應溫度、顯色時間等，最終得到其IC20(抑制率為20%時的標準溶液質量濃度)＜1ng/mL、半數(shù)抑制量(IC50)為7.6ng/mL，線性方程為y =－0.2798x＋0.7456，R2=0.991。直接ELISA總耗時只需大約1h。

新霉素；間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗；直接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗

動物性食品的安全問題已成為社會各界極為關注的食品安全熱點問題。新霉素殘留因為其潛在的致癌性以及其他不良作用對人類的健康造成極大的威脅。作為一種重要的獸用抗生素，新霉素在奶牛等家畜的疾病治療中有較為廣泛的應用[1-6]。但是，由于使用不規(guī)范等原因、常常導致新霉素在動物性食品中過量殘留。新霉素藥物殘留對人體健康產生有害的影響，主要表現(xiàn)為耐藥性增加及腸道菌的紊亂、產生過敏性反應及中毒、干擾激素平衡及癌變、急性中毒、污染環(huán)境及生態(tài)毒性[7-10]。因此，許多國家和地區(qū)都對新霉素制訂了最高殘留限量[11-13]。本實驗旨在研究新霉素殘留的間接和直接競爭ELISA檢測方法以及實驗方案的優(yōu)化、標準曲線的繪制以及樣品回收率的研究，以期為食品安全監(jiān)督以及技術儲備提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清蛋白(bovine serum albumin)、卵清白蛋白(ovalbumin)、考馬斯亮藍G250 上海伯奧生物科技公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase) 北京拜爾迪生物公司；硫酸新霉素(NEO) 美國Sigma公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(HRP-IgG) 康成生物工程公司；NEO抗體 自制；新霉素標準品 中國藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設備

AB104-N型電子分析天平 上海Metller Toledo公司；UV-2802PCS紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；101-A型電熱恒溫鼓風干燥箱 通州市扈通制藥機械設備廠；81-2型恒溫磁力加熱攪拌器 江陰市周莊電器五金廠；KFLO純水機 廈門凱佛隆公司；Costar96孔8×12可拆酶標板 上海吉泰生物科技有限公司；Anke TGL-16C離心機 上海安亭科學儀器廠；ZD-9556水平搖床 太倉科教器材廠；MuLtiska Mks 酶標儀 芬蘭Thermo Labsystems公司；凝膠電泳儀 美國Thermo公司；XevoTM QTof質譜儀、沃特世MassLynx 質譜軟件 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 包被原的合成

稱取20mg新霉素和20mg卵清白蛋白溶于PBS溶液(0.01mol/L，pH7.4)攪拌均勻(20min)，稱70mg EDC加入到上述混合液中，攪拌反應4h，然后進行透析(20℃條件下用0.01mol/L PBS透析3d，12h換一次透析液)，透析結束之后，4℃條件保存。

1.3.2 酶標記抗原的合成

1.3.2.1 HRP酶的活力測定

用碳酸鹽緩沖溶液(pH9.2)配制HRP 0.01μ mol/L酶溶液，再稀釋10倍，取10μL HRP溶液與100μL TMB底物反應，反應時間分別為30s和1、1.5、2、2.5、3min，用100μL 2mol/L硫酸中止，測吸光度(A)。

1.3.2.2 HRP酶的活化

在試管中加入臨時配制的0.1mol/L碳酸鹽緩沖液0.5mL，與10mg HRP酶混合；加12mmol/L NaIO4液0.5mL，蓋上試管蓋，20℃避光反應2h。

1.3.2.3 偶聯(lián)

15mg NEO溶于2mL 0.1mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.2)；室溫反應3h；加臨時配制的NaBH4(用0.1mmol/L NaOH配制成5mg/mL)300μL，室溫攪拌反應1h；透析2d，每天換液兩次；用1:1比例的甘油避光保存在－20℃的冰箱中；將偶聯(lián)的酶標抗原(Ag-E)和HRP酶分別做質譜圖和高效液相色譜圖。

1.3.3 工作濃度的確定

抗體包被：用包被緩沖液(pH9.6)將酶標抗原(Ag-E)系列稀釋至250、500、1000、2000、4000、8000、16000、32000倍，在每孔中加100μL，37℃孵育2h。之后取出微孔板倒空孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。

封被：每孔加200mL封閉液，于37℃孵育2h，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。

抗原抗體反應：用抗體緩沖液將抗體(Ab)稀釋成不同的倍數(shù)(250、500、1000、2000、4000、8000、16000、32000)，每孔加入100μL，置于37℃ 30min。倒空液體，用洗劑緩沖液洗3次，每次3min。

加底物顯色：于各孔中加入臨時配制的顯色液(TMB:底物緩沖液=1:5，V/V)100μL，反應15min，于各孔中加入2mol/L硫酸100μL終止反應。

測定A450nm選取最適工作濃度。

1.3.4 標準曲線的建立

通過以上實驗選取酶標抗原/抗體(Ag-E/Ab)最適工作濃度為64000/1000和128000/1000；將以最佳稀釋度1000的抗體包被96孔酶標板100μL/孔，37℃孵育2h；取出酶標板，回至室溫(24℃左右)，每孔加200μL、pH7.4、體積分數(shù)0.05% Tween-20的PBST洗液，搖床振蕩3min，用力甩掉洗液，在吸水紙上拍干，再重復洗滌2次；添加封閉液200μL/孔，37℃孵育2h；取出酶標板，按步驟2洗滌，再放入37℃溫育箱內烘干15min；取出酶標板，第一排加50μL/孔的PBS(0.01mol/L)溶液，從第二排起分別加7個質量濃度(1、2.5、5、10、25、50、100ng/mL)的標準溶液(用0.01mol/L PBS稀釋)50μL/孔，兩個重復；再加入以最佳稀釋度的酶標抗原64000、128000倍(用抗體稀釋液稀釋)50μL/孔，37℃/30min。取出洗3遍，拍干；每孔加入100μL顯色液(TMB與底物緩沖液比例1:5)，37℃烘箱反應15min，取出每孔加入100μL終止液(2mol/L硫酸)，用酶標儀測定450nm處的吸光度(A450nm)；求出各濃度的B/B0值，B0為標準溶液為0ng/mL時的吸光度。以B/B0為縱坐標，以標準溶液濃度的對數(shù)值為橫坐標作圖，即得NEO的競爭標準曲線。

2 結果與分析

2.1 新霉素直接ELISA檢測方法酶標記抗原的合成

2.1.1 HRP酶的活力測定

圖1 偶聯(lián)前后酶活力的比較Fig.1 Comparison of enzyme activity before and after coupling

一個酶活性單位定義為每分鐘在403nm波長處吸光度的變化為1所需酶的量，酶的比活性為毫克酶蛋白的活性(U/mg)[14-15]。由圖1可以看出，HRP酶在不同反應時間中測定吸光度(403nm)，標記前后酶活性明顯降低，計算得降低到22.1%。

2.1.2 高效液相色譜與質譜圖

圖2 NEO-HRP高效液相色譜-質譜圖Fig.2 HPLC-MS chromatograph of NEO-HRP

圖3 NEO-HRP峰4.369min的質譜棒狀圖Fig.3 Mass spectrogram of NEO-HRP at 4.369 min

圖4 HRP高效液相色譜-紫外檢測圖Fig.4 HPLC-UV detection of HRP

圖5 HRP峰3.842min質譜棒狀圖Fig.5 Mass spectrogram of HRP at 3.842 min

圖6 HRP的相對分子質量(峰3.842 min)Fig.6 Molecular weight of HRP (peak at 3.842 min)

由圖5和圖6可知，通過Waters MassLynx 質譜軟件，根據(jù)質荷比計算得到HRP(峰3.842min)的相對分子質量為43136.0。

圖7 HRP峰4.063min質譜棒狀圖Fig.7 Mass spectrogram of HRP at 4.063 min

圖8 HRP的相對分子質量(峰4.063min)Fig.8 Molecular weight of HRP (peak at 4.063 min)

由圖7和圖8可知，通過沃特世 MassLynx 質譜軟件，根據(jù)質荷比計算得到HRP(峰4.063min)的相對分子質量為41940.0。

圖9 HRP峰5.219min質譜棒狀圖Fig.9 Mass spectrogram of HRP at 5.219 min

綜上，由圖2～9可以看出，結果得到了并非單一酶的HRP-NEO偶聯(lián)物。

2.2 工作濃度的確定

將純化后的新霉素抗體系列稀釋250、500、1000、2000、4000、8000、16000、32000倍，將酶標抗原稀釋1000、4000、16000、64000、128000倍。用方陣滴定法確定酶標抗原和抗體的工作濃度，布板方式見表1。

表1 方陣滴定法確定工作濃度Table 1 Determination of working concentration with blocking titration

測工作點以這樣的方式布板的好處是可以找出那些符合吸光度的點。實驗中發(fā)現(xiàn)適當大的稀釋度能增加方法的靈敏度，而且適當大的抗體稀釋度能夠降低抗血清中干擾物質的干擾。因為抗血清經過純化，濃度稀釋了很多倍，因此工作濃度的稀釋倍數(shù)比純血清的工作濃度的稀釋倍數(shù)小得多由表1可見，在酶標抗原稀釋度為64000和128000，抗體稀釋倍數(shù)為1000時，吸光度為1.512和1.355時，可以確定為較佳的稀釋度。

2.3 標準曲線的制作

以B/B0為縱坐標，以新霉素標準溶液濃度的對數(shù)值(lgC)為橫坐標作圖，得到新霉素的抑制標準曲線方程為y=－0.2525x＋0.6673，R2=0.983，計算得半數(shù)抑制量(IC50)為4.7ng/mL，線性范圍為1.0～100.0ng/mL。作為用以定量檢測的標準曲線，以達到檢測的要求。

2.4 直接ELISA方法的優(yōu)化

本實驗分別對下列參數(shù)進行優(yōu)化。實驗完全按照優(yōu)化的順序進行。每個參數(shù)的優(yōu)化都采用了之前優(yōu)化的參數(shù)作為實驗條件。評判的依據(jù)很多，本研究采用IC50、Amax以及Amax/IC50來作為整個優(yōu)化過程的依據(jù)。IC50是個很重要的參數(shù)，很多文獻中都用此來作為判斷依據(jù)。

2.4.1 包被緩沖液的影響

表2 包被緩沖液的優(yōu)化Table 2 Optimization of coating buffer

本實驗考察兩種常用包被液(碳酸鹽緩沖液、0.01mol/L PBS)對確定工作濃度的影響。從表2可知，在相同工作濃度下，A隨著包被液的不同只有輕微改變，因此，不同的包被緩沖液對于工作濃度的選擇影響很小。

表3 包被溶液的優(yōu)化(Ab1000/Ag64000)Table 3 Optimization of coating antigen (Ab 1000/Ag 64000)

本實驗考察兩種常用包被液(碳酸鹽緩沖液、0.01mol/L PBS)對抑制曲線的影響。從表3可見，Amax隨著碳酸鹽緩沖液，PBS溶液順序依次降低。兩種包被液對IC50的影響變化很大。以兩者的比例Amax/IC50來看，碳酸鹽緩沖液的值遠大于PBS。因此，碳酸鹽緩沖液為較理想的選擇。

2.4.2 封閉液的影響

表4 封閉液的優(yōu)化(Ab1000/Ag64000)Table 4 Optimization of blocking solution (Ab 1000/Ag 64000)

本實驗考察3種封閉液：0.1%明膠、1% OVA、1%酪氨酸對標準曲線的影響。從表4可見，Amax隨著酪氨酸、明膠、OVA順序依次降低。3種封閉液對IC50的影響變化很大。以兩者的比例Amax/IC50來看，0.1%明膠作為封閉液的值遠大于其余兩個。因此，0.1%明膠為較理想的選擇。

2.4.3 pH值的影響

表5 酶標抗體稀釋液的pH值對ELISA的影響(Ab1000/Ag64000)Table 5 Effect of pH of labeled antibody diluent on ELISA (Ab 1000/Ag 64000)

從表5可以看到，pH值過低(pH4.0)或過高(pH10.0)均會導致抗體抑制能力的下降，甚至沒有抑制。pH6.0～8.0時，IC50抑制較好，故選pH7.4的酶標抗原稀釋液為最佳pH值。

2.4.4 競爭時間的影響

表6 競爭時間的優(yōu)化(Ab1000/Ag64000)Table 6 Optimization of competition time (Ab 1000/Ag 64000)

表6是抗體與新霉素在不同競爭時間內反應所得到的結果。隨著時間的增加，Amax有所變化，IC50先隨著時間下降而后又上升。因此，選擇30min為最佳競爭時間。

2.4.5 溫度的影響

表7 反應溫度的優(yōu)化(Ab1000/Ag64000)Table 7 Optimization of reaction temperature (Ab 1000/Ag 64000)

表7是反應溫度分別為20℃和37℃的直接競爭ELISA結果。其中，Amax的值隨溫度增加而升高。因此，在37℃時，吸光度較高，而且IC50也很理想，所以選擇37℃。

2.4.6 顯色時間的影響

表8 顯色時間的優(yōu)化(Ab1000/Ag64000)Table 8 Optimization of chromogenic time (Ab 1000/Ag 64000)

表8是顯色時間分別為5、15min和25min的ELISA結果。其中，Amax的值隨時間增加而增大，然而空白值也隨之增加，從0.07增加到0.85左右。因此，顯色時間不能再增加，否則，本底將會很高，不可取。在15min時，吸光度較高，而且IC50也很理想，所以選擇15min作為顯色時間。

當所有相關條件確定后，采用包被緩沖液為pH9.6、0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，包被時間為2h(37℃)，ELISA用的溶液系統(tǒng)為pH7.4，0.01mol/L的PBS溶液，競爭時間為37℃孵育0.5h，顯色時間15min，封閉緩沖液為明膠，進行ELISA的綜合實驗，以B/B0為縱坐標，以新霉素標準溶液質量濃度的對數(shù)值(lgC)為橫坐標作圖，得到新霉素的抑制標準曲線其IC20(抑制率為20%時的標準溶液質量濃度)＜1ng/mL、半數(shù)抑制量(IC50)為7.6ng/mL，線性方程為y=－0.2798x＋0.7456，R2=0.991。適合食品中新霉素的檢測應用。

2.4.7 樣品回收率的測定

通過計算得牛奶樣品中的新霉素添加回收率，如表9所示。

表9 牛奶中的新霉素添加回收率Table 9 Recovery rate of spiked neomycin in milk

由表9可以看出，新霉素在牛奶中的添加值5.0ng/g和50ng/g，添加回收率分別為81.60%和89.88%，添加回收率隨添加量的增加而有所增加。

3 結 論

本實驗將新霉素半抗原與牛血清白蛋白和卵清白蛋白分別交聯(lián)制成免疫抗原和包被抗原，以此為基礎設計并優(yōu)化了間接競爭ELISA方法以及直接競爭ELISA方法，主要結論如下：利用戊二醛法合成了NEO的免疫原NEO-BSA，用碳化二亞胺 (EDC)法包被抗原NEOOVA，高碘酸鈉法合成酶標抗原NEO-HRP；建立間接競爭ELISA方法檢測NEO。最終得到標準曲線方程為y＝－0.1405x＋1.3753，R2=0.977，半數(shù)抑制量(IC50)為9.6ng/mL，線性范圍為0.5～50.0ng/mL；建立直接競爭ELISA方法。通過一系列參數(shù)的優(yōu)化，包括包被溶液、封閉溶液、抗體反應時間、抗體稀釋液pH值、反應溫度、顯色時間等，最終得到其IC20(抑制率為20%時的標準溶液質量濃度)＜1ng/mL、半數(shù)抑制量(IC50)為7.6ng/mL，線性范圍為1～100ng/mL，線性方程為y=－ 0.2798x＋0.7456，R2=0.991。

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Direct Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) for Neomycin

XU Nai-feng，XU Chuan-lai，KUANG Hua，QU Chang-long，XU Yang，PENG Chi-fang*
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The neomycin (NEO) was coupled with ovalbumin (OVA) to form a coating antigen NEO-OVA by EDC method and determined by SDS-PAGE. The NEO was coupled with horseradish peroxidase (HRP) by NaIO4 method to establish enzymatic tracer NEO-HRP and direct competitive ELISA. Then, the parameters coating liquid, pH, incubation time and incubation temperature of direct ELISA were optimized. The IC20 value (20% inhibitory concentration) was less than 1 ng/mL and IC50 value (50% inhibitory concentration) was 7.6 ng/mL. The linear equation was y = －0.2798x ＋0.7456, R2= 0.991. The total consumption time of direct competitive ELISA was 1 h.

neomycin；indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay；direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay

S859.84

A

1002-6630(2011)10-0212-06

2010-07-16

徐乃豐(1984—)，男，博士研究生，研究方向為殘留物檢測。E-mail：xunaifeng217@163.com

*通信作者：彭池方(1975—)，男，副教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：pcf2125@yahoo.com.cn