殼聚糖澄清甜葉菊水提液及其澄清機理探討

謝 捷，劉小景，朱興一，葉海燕，王 平*

(浙江工業大學藥學院，制藥工程省部共建教育部重點實驗室，浙江 杭州 310014)

殼聚糖澄清甜葉菊水提液及其澄清機理探討

謝 捷，劉小景，朱興一，葉海燕，王 平*

(浙江工業大學藥學院，制藥工程省部共建教育部重點實驗室，浙江 杭州 310014)

研究殼聚糖絮凝劑在甜葉菊提取液澄清過程中的作用。分別以甜葉菊水提液的澄清率和甜菊苷的損失率為指標，考察不同因素對絮凝效果的影響。通過正交試驗法確定殼聚糖絮凝的較優工藝條件為：1%殼聚糖溶液投加量2mL/g甜葉菊干葉、甜葉菊提取液質量濃度1g生藥/10mL提取液、pH6.0、溫度45℃，絮凝時間4h。在該條件下，甜葉菊水提液的澄清率為86.63%，甜菊苷的損失率為6.89%，與膜分離法澄清的效果相近，且無需特殊設備。與傳統化學絮凝法相比，殼聚糖絮凝法能更有效地保留水提液中的有效成分，具有絮凝效果好、易生物降解、對環境安全、無二次污染等優點。

甜葉菊；甜菊苷；殼聚糖；絮凝；澄清

甜葉菊(Stevia rebaudianaBertoni)屬菊科多年生草本植物，原產于南美巴拉圭和巴西[1]，我國于1976年引種成功，現已成為世界上最大的甜菊糖生產國和出口國，主產區是黑龍江、山東、安徽、江蘇、江西等省市[2]。甜菊糖苷是從甜葉菊葉子中提取的九種四環二萜糖苷的混合物，占干葉質量4%～20%，其主要成分是甜菊苷，其他低含量成分是：甜菊雙糖苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F和杜爾可苷A[3-5]。甜菊糖苷具有高甜度、低熱量、易溶解、耐熱、穩定、安全、無毒、非發酵性等特點，其甜度為蔗糖的200～300倍，而熱量僅為蔗糖的1/300，是一種可替代蔗糖的理想天然甜味劑，被譽為世界第3糖源，對高血壓、糖尿病、肥胖癥、心臟病、齲齒等病癥有一定的輔助療效，被廣泛應用于飲料和食品行業[6-7]。

目前，甜菊糖苷的制備工藝主要包括水提、除雜、大孔吸附樹脂分離純化和離子交換樹脂脫色[8]。甜葉菊水提液呈深褐色，含有大量膠體顆粒、蛋白質、色素和可溶性多糖等雜質[9-10]，必須在分離純化前對水提液進行除雜預處理，以提高甜菊糖苷產品的質量，并延長樹脂使用壽命。傳統的化學絮凝法通常采用鐵鹽或鋁鹽等無機低分子作為絮凝劑，以石灰作為助凝劑，進行酸堿中和反應，形成絮凝沉淀[11-12]。該法會給被處理液帶入大量無機離子，不利于人類健康。同時，后續處理工藝復雜，甜菊糖苷的損失率也較大，約10%～20%[13]。殼聚糖作為一種新型的有機高分子絮凝劑，主要通過電性中和作用和大分子的架橋作用，除去提取液中較大的懸浮顆粒，具有原料來源廣泛、天然無毒、可生物降解、用量少、除雜效果好等特點，廣泛應用于中藥藥液及制劑的澄清精制[14-15]。

本實驗采用殼聚糖絮凝法澄清甜葉菊水提液，以甜葉菊水提液的澄清率和甜菊苷損失率為指標對絮凝工藝進行考察，并與傳統的化學絮凝劑澄清法進行比較，為甜葉菊水提液的除雜預處理提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

安徽明光產甜葉菊，60℃烘干，粗粉碎至50目，干燥保存；殼聚糖 山東臨沂生物制品廠；甜菊苷對照品(純度＞98%) 上海融禾醫藥科技發展有限公司；甲醇(色譜純) 美國Fisher公司；庚烷磺酸鈉、氯化鐵、氧化鈣、冰醋酸、磷酸、氫氧化鈉、鹽酸(均為分析純)。

1.2 儀器與設備

Agilent-1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；HX-200高速中藥粉碎機 浙江省永康市溪岸五金藥具廠；HHS電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司；電子分析天平 上海棱譜儀器儀表有限公司；SP-752PC紫外-可見分光光度計 上海笛柏實驗設備有限公司；DELTA320 pH計 上海樹信儀器儀表有限公司；DHG-9240A鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞萊生化儀器廠；SHB-AⅢ循環水式多用真空泵 河南太康科教器材廠。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：XTerra PR18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動相配比為甲醇-0.03%庚烷磺酸鈉緩沖液(磷酸調pH3.8)(75:25，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL，檢測波長為210nm。

1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品10mg，置10mL容量瓶中，用流動相溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。經0.45μm微孔濾膜過濾，制成1mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

1.3.3 標準曲線的繪制

精密吸取甜菊苷對照品溶液2、4、6、8、10、12、14、16μL注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積(A)為縱坐標，甜菊苷含量(C/μg)為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為A＝407.39C－8.3851(R2＝0.9998)。甜菊苷含量在1.86～14.88μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

1.3.4 提取液的制備

取適量甜葉菊粗粉，按料液比1:10(g/mL)加水，70℃浸提1h，過濾后重復提取2次，合并濾液，將其體積減壓濃縮一半使提取液質量濃度為1g生藥/10mL提取液，得深褐色液體，即為甜葉菊提取液。

1.3.5 殼聚糖溶液的制備

準確稱取1.0g殼聚糖，用100mL 1%醋酸溶液溶解，得到1%殼聚糖醋酸溶液。為了防止殼聚糖在稀酸溶液中水解而影響澄清效果，殼聚糖充分溶脹后，需立即使用。

1.3.6 甜葉菊提取液的絮凝澄清

1.3.6.1 殼聚糖絮凝法

量取甜葉菊水提液100mL，加入殼聚糖溶液，攪拌5min，調節pH值至規定值，水浴靜置一定時間，減壓抽濾，濾液冷卻后定容至100mL，即為殼聚糖絮凝法處理后的樣品溶液。

1.3.6.2 化學絮凝法[16]

量取甜葉菊水提液100mL，加入絮凝劑和助凝劑，調節pH10.0，攪拌10min，置于65℃水浴中靜置40min，減壓抽濾，濾液冷卻后定容至100mL，即為化學絮凝法處理后的樣品溶液。

1.3.7 提取液澄清率的測定[9-10]

以蒸餾水做參比，測定甜葉菊提取液在670nm處的吸光度A0及樣品溶液在上述波長處的吸光度A1，澄清率B(%)按下式計算：

1.3.8 甜菊苷損失率的測定

量取提取液和絮凝后的樣品溶液各1.0mL，置10mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，HPLC法測定甜菊苷的含量，損失率P(%)按下式計算：

式中：P為損失率；C0、C1分別為提取液和樣品溶液中甜菊苷的含量。

1.3.9 單因素試驗

分別以殼聚糖的投加量、提取液質量濃度、提取液pH值、體系溫度及絮凝時間作單因素試驗，考察各單因素對絮凝效果的影響。

1.3.10 殼聚糖絮凝法工藝優化正交試驗

根據單因素試驗的結果，選定殼聚糖投加量、提取液質量濃度、提取液pH值和體系溫度4個因素進行L9(34)正交試驗，以甜葉菊水提液的澄清率和甜菊苷損失率為指標，考察上述4個因素對澄清效果的綜合影響。試驗因素水平見表1。

表1 殼聚糖絮凝法澄清甜葉菊水提液正交試驗因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design

2 結果與分析

2.1 殼聚糖絮凝法單因素試驗

2.1.1 殼聚糖投加量對澄清效果的影響

取甜葉菊水提液600mL，平均分成6份，分別按0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8mL/g(殼聚糖溶液體積/甜葉菊干葉質量)的投加量加入殼聚糖溶液，調節pH6.0，攪拌5min，于45℃水浴中靜置4h后，減壓抽濾，測定提取液和樣品溶液的吸光度和甜菊苷含量，并計算澄清率和甜菊苷的損失率。結果如圖1所示。

圖1 殼聚糖投加量對澄清效果的影響Fig.1 Effect of chitosan dosage on clarification rate and stevioside loss rate

由圖1可知，隨殼聚糖投加量的增加，溶液的澄清率逐漸提高，但甜菊苷的損失率也不斷增加。當殼聚糖投加量超過2.0mL/g時，溶液的澄清率開始下降，繼續增加殼聚糖投加量至2.8mL/g時，溶液的澄清率下降至45.08%，此時，甜菊苷的損失率增加至14.08%。殼聚糖用量較少時，不足以和膠體顆粒、蛋白質、鞣質等雜質分子發生吸附架橋和電中和作用，不能充分使雜質絮凝沉淀；隨著殼聚糖加入量的增加，吸附架橋和電中和作用加強，提高了溶液的澄清率，同時，少量甜菊苷也被絮凝沉淀，使甜菊苷的損失率緩慢增加。加入過量的殼聚糖后，溶液的澄清率反而降低，這是因為過量的絮凝劑會使膠體顆粒表面發生二次吸附，使膠粒表面覆蓋一層絮凝劑分子，而使其產生再穩定現象，溶液濁度升高，同時，過量的絮凝劑會增加甜菊苷的絮凝損失。因此，綜合考慮提取液的澄清率和甜菊苷的損失率，選擇殼聚糖投加量以2.0mL/g為宜。

2.1.2 甜葉菊提取液質量濃度對澄清效果的影響

取甜葉菊水提液600mL，平均分成6份，其中一份稀釋至1/12(甜葉菊提取液質量濃度，g/mL)，一份不變，其余4份則分別濃縮至1/8、1/6、1/4、1/2(g/mL)。按2.0mL/g的投加量分別加入殼聚糖溶液，調pH6.0，攪拌5min，于45℃水浴中放置4h，減壓抽濾，測定提取液和樣品溶液的吸光度和甜菊苷含量，并計算澄清率和甜菊苷損失率。結果如圖2所示。

圖2 甜葉菊提取液質量濃度對澄清效果的影響Fig.2 Effect of concentration of water extract from Stevia rebaudiana Bertoni leaves on clarification rate and stevioside loss rate

由圖2可知，隨甜葉菊水提液質量濃度的提高，澄清率變化不大，而甜菊苷的損失有明顯增加。提取液質量濃度較高時，甜菊苷易被所形成的沉淀吸附、包裹，當提取液質量濃度超過1/10(g/mL)時，損失率增加明顯。因此，甜葉菊水提液質量濃度以1/10(g/mL)為宜。

2.1.3 體系pH值對絮凝效果的影響

圖3 體系pH值對絮凝效果的影響Fig.3 Effect of flocculation pH on clarification rate and stevioside loss rate

取甜葉菊水提液600mL，平均分成6份，按2mL/g的投加量加入殼聚糖溶液，調pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，攪拌5min，于45℃水浴中放置4h，減壓抽濾，測定提取液和樣品溶液的吸光度和甜菊苷含量，并計算澄清率和甜菊苷損失率。結果如圖3所示。

由圖3可知，當提取液pH值小于6.0時，澄清率隨pH值的增大而提高，甜菊苷的損失隨pH值的增大而減少。這是因為殼聚糖分子上有大量的氨基，在弱酸性(pH6)條件下，氨基顯示陽離子性質，與提取液中帶負電荷的膠體顆粒、鞣質、蛋白質、色素結合而沉降。酸性越強，殼聚糖氨基所帶的正電荷越多，絮凝能力越強，另一方面，也會導致減弱甚至逆轉膠體顆粒、鞣質、蛋白質、色素表面的負電性，使其與殼聚糖的結合能力減弱甚至相互排斥，因此，隨pH值從6.0下降至3.0，澄清率下降，并伴隨著甜菊苷損失的明顯增加。當提取液pH值大于6.0時，隨著pH值的增大，氨基顯示非離子性質，殼聚糖的電中和作用受到抑制，削弱了絮凝作用，故澄清率下降。因此，提取液pH6.0為宜。

2.1.4 體系溫度對絮凝效果的影響

取甜葉菊水提液600mL，平均分成6份，按2mL/g加入殼聚糖溶液，調pH6.0，攪拌5min，分別于25、35、45、55、65、75℃恒溫水浴中放置4h，減壓抽濾，測定提取液和樣品溶液的吸光度和甜菊苷含量，計算澄清率和損失率。結果如圖4所示。

圖4 體系溫度對澄清效果的影響Fig.4 Effect of flocculation temperature on clarification rate and stevioside loss rate

由圖4可知，當水浴溫度低于35℃時，隨溫度的提高，溶液中的大分子雜質與殼聚糖分子相互碰撞的幾率增大，加速了絮凝沉淀的過程，有利于提取液的澄清。溫度升高也使甜菊苷的水溶性增強，幫助吸附在絮凝體上的甜菊苷重新返回溶液，減少其損失。當溫度過高時(＞65℃)，易使殼聚糖分子發生老化，影響澄清效果。因此，體系溫度選擇35～65℃為宜。

2.1.5 絮凝時間對絮凝效果的影響

取甜葉菊水提液600mL，平均分成6份，按2mL/g的投加量加入殼聚糖溶液，調pH6.0，攪拌5min，于45℃水浴中分別放置1、2、3、4、5、6h，減壓抽濾，測定提取液和樣品溶液的吸光度和甜菊苷含量，計算澄清率和損失率。結果如圖5所示。

圖5 絮凝時間對澄清效果的影響Fig.5 Effect of flocculation time on clarification rate and stevioside loss rate

由圖5可知，隨絮凝時間的延長，殼聚糖與膠體顆粒、蛋白質等大分子雜質形成的絮凝沉淀越多且結構穩定，澄清效果好，被吸附的甜菊苷略有增加；當絮凝時間超過4h，澄清率達到最高并穩定在85%以上，溶液中甜菊苷的含量基本保持不變。因此，選擇絮凝4h為宜。

2.2 殼聚糖絮凝法澄清甜葉菊水提液正交試驗

表2 殼聚糖絮凝法澄清甜葉菊水提液正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results

表3 澄清率正交試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance of clarification rate

表4 損失率正交試驗結果方差分析Table 4 Analysis of variance of stevioside loss rate

由表2～4可知，影響提取液澄清率和甜菊苷損失率的4因素的重要程度均依次為殼聚糖投加量(A)＞提取液pH值(C)＞提取液質量濃度(B)＞體系溫度(D)。從澄清率角度分析，殼聚糖投加量是影響澄清率的顯著因素，最優組合是A2B1C2D3；從損失率角度分析，殼聚糖投加量為極顯著因素，pH值是顯著因素，最優組合為A1B3C3D3。絮凝除雜是甜菊苷分離純化前的重要工序，綜合考慮澄清率和損失率，較優的工藝組合為A2B2C2D3，即殼聚糖投加量2mL/g、提取液質量濃度1/10(g/mL)、pH6.0、溫度45℃、絮凝時間4h。

2.3 殼聚糖絮凝法和膜分離法的比較

表5 殼聚糖絮凝法與膜分離法的比較Table 5 Comparison between chitosan flocculation and membrane separation

Reis[17]等和Silva等[10]采用膜分離法澄清甜葉菊提取液，提取液的澄清率可達到90%以上，甜菊苷損失率低于10%。前者冷水浸提后直接用膜分離法澄清；后者冷水浸提后，經分子篩除雜預處理，再用膜分離法澄清。趙永良等[18]采用膜分離法處理浸提的甜葉菊提取液，提取液澄清率81.13%，損失率11.04%。分析原因可能是當提取液雜質較多時，膜容易污染，影響膜的流通量和分離效果。而殼聚糖絮凝法用于熱水浸提液的澄清也能達到相近效果，兩者都不會引入無機離子。此外，膜分離法通常需要特殊的設備，單獨一次膜分離很難達到理想的效果。如Zhang等[19]通過微濾、超濾、納濾3次膜處理來澄清甜葉菊提取液，而殼聚糖絮凝法無需特殊的儀器，操作簡便。

2.4 殼聚糖絮凝法和傳統絮凝法的比較

按照優化的殼聚糖絮凝法和傳統化學絮凝法工藝條件對甜葉菊水提液進行預處理，其中化學絮凝法選取了澄清效果較好的絮凝劑與助凝劑組合FeCl3:CaO(質量比，1:2.5)。

殼聚糖絮凝法預處理試驗重復驗證3次，得甜葉菊提取液的平均澄清率為86.63%，甜菊苷的平均損失率為6.89%。化學絮凝法預處理結果如表6所示。

表6 化學絮凝法澄清試驗結果Table 6 Clarification rates and stevioside loss rates using different amounts of FeCl3:CaO as the floccutant

由表6可知，雖然化學絮凝劑的絮凝能力較強，但同時對有效成分的吸附能力也較強，造成了甜菊苷的損失率較高。在取得相近澄清效果的條件下為化學絮凝法85.38%，殼聚糖絮凝法86.63%)，兩者甜菊苷的損失率差異明顯(化學絮凝法26.27%，殼聚糖絮凝法6.89%)。殼聚糖絮凝法能有效的保留溶液中的有效成分，投加量少，安全無毒，完全可以替代傳統化學絮凝法。

3 結 論

通過單因素和正交試驗優化，得到了殼聚糖絮凝法澄清甜葉菊提取液的較佳工藝條件為殼聚糖投加量2mL/g、提取液質量濃度1/10(g/mL)、提取液pH6.0、體系溫度45℃、絮凝時間4h。在上述條件下，甜葉菊提取液的平均澄清率為86.63%，甜菊苷的平均損失率僅為6.89%。殼聚糖絮凝法和膜分離法的澄清效果相近，且無需特殊設備；與傳統化學絮凝法相比，殼聚糖絮凝法能更有效的保留甜菊苷，應用過程中不會帶入無機離子，具有投加量少，操作簡單，安全無毒等優點，是一種適用于工業化生產的絮凝工藝。

[1]HANSON J R, DEOLIVEIRA B H. Stevioside and related sweet diterpenoid glycosides[J]. Natural Product Reports, 1993, 10(3): 301-309.

[2]孫傳范, 李進偉. 甜菊糖苷研究進展[J]. 食品科學, 2010, 31(9): 338-340.

[3]GEUNS J M C. Stevioside[J]. Phytochemistry, 2003, 64(5): 913-921.

[4]CHATSUDTHIPONG V, MUANPRASAT C. Stevioside and related compounds: therapeutic benefits beyond sweetness[J]. Pharmacology & Therapeutics, 2009, 121(1): 41-54.

[5]STARRATT A N, KIRBY C W, POCS R, et al. Rebaudioside F, a diterpene glycoside fromStevia rebaudiana[J]. Phytochemistry, 2002, 59(4): 367-370.

[6]倪軍明, 李軍平. 甜菊糖工業發展現狀與前景[J]. 廣州食品工業科技, 2004, 20(3): 156-158.

[7]邵佩霞. 蔗糖對酶法改性甜菊糖的影響研究[J]. 食品工業科技, 2010, 31(3): 187-189; 192.

[8]伏軍芳, 黃新異, 宋玉民, 等. 甜葉菊水提取液的除雜工藝研究[J].化學世界, 2010, 51(2): 126-128.

[9]MORAES E D P, MACHADO N R C F. Clarification ofStevia rebaudiana(Bert.) Bertoni extract by adsorption in modified zeolites[J]. Acta Scientiarum Universidade Estadual de Maringa, 2001, 23(6): 1375-1380.

[10]SILVA F V, BERGAMASCO R, ANDRADE C M G, et al. Purification process of stevioside using zeolites and membranes[J]. International Journal of Chemical Reactor Engineering, 2007(5): 7.

[11]邵佩霞, 徐仲偉, 王永華, 等. 甜葉菊水提液的高效絮凝新工藝研究[J]. 食品工業, 2009, 30(2): 11-14.

[12]MALSAGOV M, KUALA L, TUGAN T, et al. Process for manufacturing a sweetner and use thereof: US, 0082103 A1[P]. 2007-04-12.

[13]顧正榮, 劉露露. 毛細管電泳法應用于甜菊葉的絮凝工藝[J]. 光譜實驗室, 2008, 25(6): 1080-1083.

[14]刑佶勇, 張愛麗, 周集體, 等. 殼聚糖作為絮凝劑的研究進展[J]. 環境科學與技術, 2004, 27(增刊1): 153-155.

[15]陳英, 李永吉, 程淑云, 等. 殼聚糖絮凝法精制紅花水提液工藝的研究[J]. 時珍國醫國藥, 2007, 18(5): 1167-1168.

[16]張雪穎, 徐仲偉, 戰宇, 等. 甜葉菊水提液的絮凝研究[J]. 現代食品科技, 2006, 23(2): 8-10.

[17]REIS M H M, DA SILVA F V, ANDRADE C M G, et al. clarification and purification of aqueous stevia extract using membrane separation process[J]. Journal of Food Process Engineering, 2009, 64 (5): 913-921.

[18]趙永良, 韓驍, 劉景彬, 等. 膜分離技術改進傳統甜菊糖甙生產工藝的研究[J]. 廣州化工, 2010, 37(1): 40-41.

[19]ZHANG S Q, KUMAR A, KUTOWY O. Membrane-based separation scheme for processing sweeteners from stevia leaves[J]. Food Research International, 2000, 33(7): 617-620.

Application of Chitosan Flocculation Method in Clarification of Water Extract fromStevia rebaudianaBertoni Leaves and Flocculation Mechanism Analysis

XIE Jie，LIU Xiao-jing，ZHU Xing-yi，YE Hai-yan，WANG Ping*
(Zhejiang Key Laboratory of Pharmaceutical Engineering, College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

The effect of chitosan flocculation on clarifying water extract fromStevia rebaudianaBertoni leaves, prepared by twice repeated water extraction at a solid/liquid ratio of 1:10 (g/mL) followed by pooling and then rotary evaporation concentration of two extracts, was studied. Clarification rate and stevioside loss rate were investigated with respect to different factors. Using orthogonal array design method, the optimal process conditions for chitosan flocculation were determined as follows: ratio between 1% acetic acid solution of chitosan and driedStevia rebaudianaBertoni leaves 2:1 (mL/g), 1-fold concentration of pooled extracts fromStevia rebaudianaBertoni leaves, pH 6.0, flocculation temperature 45 ℃, and flocculation time 4 h. Under these conditions, a clarification rate of 86.63% and a stevioside loss rate of 6.89% were achieved. Chitosan flocculation without the need for special equipment had similar effectiveness to that of membrane separation in clarifying water extract fromStevia rebaudianaBertoni leaves. Compared with the conventional chemical flocculation, chitosan flocculation could more effectively retain effective ingredients in the water extract and had the advantages of effective flocculation, ready biodegradation, environmental safety and non-secondary contamination.

Stevia rebaudianaBertoni；stevioside；chitosan；flocculation；clarification

TS202.3

A

1002-6630(2011)20-0001-06

2010-10-28

浙江省重點國際合作項目(2009C14001)

謝捷(1978—)，女，講師，博士研究生，研究方向為天然產物。E-mail：xiejie97@sohu.com

*通信作者：王平(1969—)，女，教授，博士，研究方向為天然產物。E-mail：pharmlab@zjut.edu.cn