聚丙烯微孔膜固定化轉谷氨酰胺酶在大豆乳清廢水處理中的應用

馬永強，韓春然，張 娜，佟曉芳，張毅方，劉 穎

(1.哈爾濱商業大學 黑龍江省食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.黑龍江省食品質量監督檢驗一站，黑龍江 哈爾濱 150010；3.哈高科大豆食品有限責任公司，黑龍江 哈爾濱 150078)

聚丙烯微孔膜固定化轉谷氨酰胺酶在大豆乳清廢水處理中的應用

馬永強1，韓春然1，張 娜1，佟曉芳2，張毅方3，劉 穎1

(1.哈爾濱商業大學 黑龍江省食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.黑龍江省食品質量監督檢驗一站，黑龍江 哈爾濱 150010；3.哈高科大豆食品有限責任公司，黑龍江 哈爾濱 150078)

將固定化轉谷氨酰胺酶酶膜應用到酶膜反應器中，對大豆乳清廢水進行催化使其發生聚合并被截留，從而減輕大豆乳清廢水對環境的污染，并確定其最佳影響條件，得出在最佳條件下進行處理的蛋白截留率為78.4%。對處理前后大豆乳清廢水進行分析，其主要成分指標發生了很大變化，如蛋白質含量、生化需氧量(biochemical oxygen demand，BOD)值、化學需氧量(chemical oxygen demand，COD)值、灰分含量等指標較處理前發生顯著下降。

轉谷氨酰胺酶；聚丙烯微孔膜；大豆乳清廢水；固定化酶；催化

生產大豆分離蛋白過程中產生的乳清一直是環保治理的難點，乳清中含有乳清蛋白，大豆低聚糖和鹽類等物質，這些有效成分排放到自然水體中不僅造成資源浪費，而且對水構成嚴重污染，生化需氧量(biochemical oxygen demand，BOD)、化學需氧量(chemical oxygen demand，COD)值嚴重超標[1-2]。因此，設法回收大豆乳清廢水中有用成分不僅可提高原料利用率，并且可大大減輕廢水對環境的污染。

轉谷氨酰胺酶是一種能催化多肽或蛋白質的谷氨酰胺殘基的γ-羥胺基團(酰基的供體)與許多伯胺化合物(酰基受體)之間的酰基轉移反應的酶[3-4]。經過轉谷氨酰胺酶改性后，蛋白質分子可以實現交聯，提高其分子質量水平并使其某些物化特性得到改善[5-6]。

目前，大豆乳清廢水的處理方法是直接將其進行多級生物處理，利用厭氧和好氧的方法降低廢水中的COD及BOD值[7]，但是僅此很難達到國家排放標準。固定化酶膜具有聚合大豆乳清蛋白的作用，并且固定化酶膜的一個重要應用領域是酶膜反應器，近年來酶膜反應器用于污水處理，尤其是水中酚的降解也成為研究熱點之一[8-10]。酶膜反應器能將酶的催化特性與膜的優良性能結合，使化學反應和產品分離同時進行，并且有效地加速反應，突破化學平衡的限制，提高轉化率[11]。因此，酶膜反應器已被廣泛地應用于化工、制藥、環保、食品工業等領域。通過選擇適當大小孔徑的膜，使底物在酶膜表面反應，但不透過膜，而小分子物質能透過膜，從而達到純化的目的[12]。近幾年酶的膜固定化技術己有了很大發展，但仍有很大的進步潛力。對現有膜材料的改性、開發新膜材料、采用新的固定化技術、分子識別固定化、定點固定化、多酶系統共固定將成為這一領域的發展方向[13]。

本研究以工業生產大豆分離蛋白的副產物大豆乳清廢水為原料，用實驗室制備好的固定化轉谷氨酰胺酶酶膜應用到酶膜反應器中，使大豆乳清廢水中的大豆乳清蛋白凝聚并且被截留，并對催化凝聚前后的大豆乳清廢水的主要成分進行分析[14]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

固定化轉谷氨酰胺酶 實驗室自制；大豆乳清廢水哈爾濱高科技有限責任公司；標準蛋白(14～100kD) 北京全式金生物技術有限公司；鹽酸 哈爾濱市新達化工廠；冰醋酸、醋酸鈉 天津市天新精細化工開發中心；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 哈爾濱市新春化工廠；甲醇、硫酸鉀、濃硫酸、氫氧化鈉硫酸銅 哈爾濱市化學試劑廠；硼酸、葡萄糖、蒽酮、硫脲 北京化學試劑公司。

Spectrum722E型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；SY-2-4型恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器儀表有限公司；固定化酶膜反應器裝置 實驗室自制。1.2 方法

1.2.1 酶膜反應器裝置

根據大豆乳清廢水中的分子質量分布，選擇截留分子質量分別為25000D的膜進行固定化后，應用到酶膜反應器中進行反應。采用實驗室通過臭氧活化方法制備得到的聚丙烯微孔膜-轉谷氨酰胺酶進行固定化酶膜反應器的制備。經實驗室優化得到的聚丙烯微孔膜上的載轉谷氨酰胺酶量為30.23mg/g膜，并且酶膜活力可達16.9U/g。

反應裝置主要包括4個部分：預熱罐、螺桿泵、酶膜反應器、產物收集器。其主要工作流程為：將預處理后的大豆乳清廢水過濾，加入到預熱罐中，調節到所需的溫度及pH值后，物料經螺桿泵通過轉子流量計進入酶膜反應器中，借助酶膜反應器內葉輪的作用使大豆乳清廢水與酶膜充分接觸，并使其聚合，大分子物質被膜截留，收集到產物收集器中，小分子物質及未被聚合的蛋白透過膜后通過管道再次進入到預熱罐中，再次循環作用。本研究采用大量45℃熱水反向連續通過酶膜表面的清洗方式。清洗完的酶膜反應器，通透量等恢復正常[15]。

1.2.2 酶膜反應器處理大豆乳清廢水條件確定

將大豆乳清廢水升溫分別為30、35、40、45、50、55℃，緩慢均勻加入NaOH溶液(分別調節pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8、10)，然后加入CaCl2溶液，并與直接均勻加入Ca(OH)2并分別調節pH8、10的體系進行對比。通過調節轉子流量計的顯示，設定不同物料流速分別為50、70、90、110、130、150mL/min。觀察絮凝沉淀效果確定最佳預處理方法，通過測定不同條件聚合前后的大豆乳清廢水的蛋白質含量，根據蛋白截留率確定最佳聚合溫度、最佳pH值、物料流速[16]。1.2.3 酶膜反應器的重復使用性的測定

取反應一段時間后的載荷轉谷氨酰胺酶的聚丙烯微孔膜進行酶膜反應器重復使用性測定，酶膜反應器的剩余酶活采用改進的分光Hydroxamate分析法進行測定[17]。以初始酶活力作為100，其余時間的剩余酶活力同其比值作為評價指標。

1.2.4 大豆乳清廢水成分分析

采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》測定大豆乳清廢水中蛋白質的含量；采用蒽酮比色法測定大豆乳清廢水中多糖含量；取廢水樣液用pH計直接測定大豆乳清廢水的pH值；采用GB 11914—2003《化學需氧量的測定》測定大豆乳清廢水中COD值，根據測定的COD值，采用稀釋接種法測定大豆乳清廢水中的BOD值；采用GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測定》測定大豆乳清廢水的灰分含量。

2 結果與分析

2.1 酶膜反應器處理大豆乳清廢水條件確定

2.1.1 大豆乳清廢水的預處理

表1 大豆乳清廢水預處理方法對比Table 1 Comparison of different pretreatments on protein precipitation in soybean whey wastewater

對大豆乳清廢水采用兩個方法進行預處理，結果進行對比，如表1所示。對大豆乳清廢水進行預處理的目的是為了去除大豆乳清廢水中大分子質量蛋白質，澄清

廢水，并使該處理后的廢水通過酶膜反應器時作用效率更高，同時對酶膜反應器具有一定保護作用。基于處理效果，本實驗選擇1.2‰的Ca(OH)2作為絮凝劑，此條件下，絮凝速度快，上清液澄清，并且絮凝后上清液的灰分最低。

2.1.2 物料溫度對聚合大豆乳清廢水的影響

圖1 物料溫度對蛋白截留率的影響Fig.1 Effect of temperature on interception rate of proteins

由圖1可知，當物料溫度小于45℃時，蛋白截留率很明顯地隨物料溫度的升高而升高，說明此時的物料溫度并不能使廢水中的蛋白充分聚合從而截留，但物料溫度升至45℃時蛋白截留率達到77%，溫度繼續升高蛋白截留率趨勢穩定，并沒有顯著變化，但是此時的蛋白有可能發生變性，因此最佳物料溫度確定為45℃。

2.1.3 物料pH值對聚合大豆乳清廢水的影響

圖2 物料pH值對蛋白截留率的影響Fig.2 Effect of pH on retention rate of proteins

由圖2可知，當pH值在5～6.5之間時蛋白截留率隨pH值的升高而升高，pH6.5時蛋白截留率達到最高76%，而當pH值繼續升高，蛋白截留率下降。由此可見，在強酸、強堿性條件下對大豆乳清蛋白的聚合效果較差。物料最佳pH值為6.5。

2.1.4 物料流速對聚合大豆乳清廢水的影響

由圖3可知，當調節物料流速為30、50、70mL/min時，蛋白截留率沒有顯著變化。而當流速為大于70mL/min，蛋白截留率呈顯著下降趨勢，此時由于流速較快，大豆乳清廢水中的蛋白在通過酶膜反應器的過程中，與固定化轉谷氨酰胺酶的作用有效接觸率降低，所以造成蛋白截留率降低，因此，最佳流速設定為70mL/min。

圖3 物料流速對蛋白截留率的影響Fig.3 Effect of feed flow rate on retention rate of proteins

2.1.5 酶膜反應器的重復使用性

圖4 酶膜衰減系數隨時間的變化Fig.4 Repeated usability evaluation of MTG-conjugated polypropylene microporous membrane

由圖4可知，酶膜反應器中酶膜活力隨工作時間的延長緩慢下降，當工作時間為24h后酶活仍然可高達50%以上，由此可證明，本實驗所制備使用的轉谷氨酰胺酶酶膜的重復使用性較好，較穩定。

2.2 聚合前后大豆乳清廢水成分對比分析

2.2.1 主要成分的分析

表2 大豆乳清廢水聚合前后主要成分分析Table 2 Variations of chemical composition of soybean whey wastewater before and after MTG treatment

大豆乳清廢水經聚合前后其主要成分指標發生了很大變化，如蛋白質含量、COD值、BOD值、灰分含量等指標較處理前發生了顯著下降，如表2所示。

2.2.2 處理前后蛋白質分子質量的分析

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析原大豆乳清廢水和在最佳條件下聚合后收集的乳清蛋白溶液分子質量分布，并做對比。如圖5所示，聚合前分子質量分布幾乎全部在20kD左右，低于30kD，而聚合后圖譜顯示，明顯在30kD以上出現幾條帶，說明此時已經有小分子蛋白聚合成大分子蛋白，并且此圖同樣可證明本實驗所選截留分子質量在25000D是符合依據的。

圖5 SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of soybean whey wastewater before and after MTG treatment

3 結 論

本研究將制備好的固定化轉谷氨酰胺酶酶膜應用到酶膜反應器中，對酶膜反應器聚合并截留大豆乳清廢水中蛋白的影響條件：物料溫度、物料pH值、物料流速進行考查，最佳條件為：物料溫度45℃、物料pH6.5、物料流速70mL/min。在最佳條件下進行處理的蛋白截留率為78.4%。本實驗檢驗了該酶膜的重復使用性，工作時間為24h后酶活仍然可高達50%以上。大豆乳清廢水經酶膜反應器處理，蛋白質含量、COD值、BOD值、灰分含量發生了尤其顯著的變化。其中蛋白質含量由原0.51%下降至0.11%，COD值由17794mg/L下降至4549mg/L，BOD值由10973mg/L下降至2586mg/L，灰分由0.71%下降至0.11%。

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Application of Polypropylene Microporous Membrane Carrying Transglutaminase to Treat Soybean Whey Waste

MA Yong-qiang1，HAN Chun-ran1，ZHANG Na1，TONG Xiao-fang2，ZHANG Yi-fang3，LIU Ying1
(1. Key Laboratory of Food Science and Engineering of Heilongjiang Province, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；2. Administration of Quality Supervision, Inspection of Heilongjiang, Harbin 150001, China；3. Harbin Hi-tech Soybean Food Company, Harbin 150078, China)

In this study, we immobilized microbial transglutaminase (MTG) onto polypropylene microporous membrane by ozone activation and then evaluated its application to treat soybean whey waste with the purpose to recover proteins and decrease pollution. The results showed that under optimal technological conditions, MTG-conjugated polypropylene microporous membrane recovered 78.4% of proteins from soybean whey waste, and significantly decreased protein and ash contents, COD value and BOD value of soybean whey waste.

microbial transglutaminase；polypropylene microporous membrane；soybean whey wastewater；enzyme immobilization；atalysis

TS252.41

A

1002-6630(2011)20-0104-04

2011-06-29

黑龍江省高校科技創新團隊建設計劃項目(2010td04)；國家“863”計劃項目(2008AA10Z303)

馬永強(1963—)，男，教授，碩士，研究方向為食品酶學、食品化學。E-mail：mayq@hrbcu.edu.cn