高效液相色譜法測定羅非魚肌肉中硝基咪唑類多組分殘留量

王 揚，鄭重鶯，何 豐，葉磊海

(浙江省水產質量檢測中心，浙江 杭州 310012)

高效液相色譜法測定羅非魚肌肉中硝基咪唑類多組分殘留量

王 揚，鄭重鶯，何 豐，葉磊海

(浙江省水產質量檢測中心，浙江 杭州 310012)

建立一種同時測定羅非魚肌肉中甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑、洛硝噠唑5種硝基咪唑類藥物殘留量的反相高效液相色譜法。水產品肌肉組織經勻漿，加氯化鈉、磷酸氫二鉀和乙酸乙酯振蕩提取，取有機相濃縮，殘余物加鹽酸和乙酸乙酯溶解，正己烷去脂后過MCX柱，2%濃氨水甲醇溶液洗脫，色譜柱分離，以醋酸氨緩沖液-乙腈(86:14，V/V)為流動相，320nm紫外檢測。結果顯示：測定肌肉組織中5種硝基咪唑類藥物的最低檢測限均為1.0μg/kg。在2.0μg/kg的加樣水平下，甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑及洛硝噠唑在羅非魚中的回收率分別為73.3%%、74.7%、62.9%、74.4%、80.1%；測定的標準偏差不大于10%。本方法簡便、靈敏度高，準確度和精密度均符合我國農業部獸藥殘留分析方法的要求。

固相萃取；高效液相色譜法；羅非魚；硝基咪唑

硝基咪唑類藥物(nitroimidazoles)屬于硝基雜環化合物，主要有甲硝唑、二甲硝咪唑、替硝唑、奧硝唑、洛硝達唑、地美硝唑等。硝基咪唑類藥物的抗原蟲活性和抗厭氧菌活性受到人們的廣泛重視。體內外毒理實驗證實，硝基咪唑類藥物對某些動物具有致癌、致突變、損傷DNA等作用[1]，對人體具有潛在致癌性。歐盟已于1993年規定禁止食品動物使用洛硝噠唑，現己全面禁止使用該藥，且規定可食性動物組織中硝基咪唑類藥物不得檢出[2-3]。我國農業部規定“禁止甲硝唑、地美硝唑作為飼料添加劑用于食品動物，禁止洛硝達唑用于所有食品動物的任何用途”[4]。

目前，國內外已有報道，研究在禽肉、蜂蜜等動物源性食品中硝基咪唑的測定方法主要有免疫法[5]、氣相色譜法[2,6]、高效液相色譜法[7-9]、液相色譜-質譜聯用法[10-12]和氣相色譜-質譜聯用法[13]，但免疫法的檢測項目有限，氣相色譜-質譜(gas chromatography-mess spectrometry，GC-MS)法需要進行衍生，GC法的靈敏度不過高。我國現有的水產行業標準中缺少硝基咪唑類藥物殘留的測定方法標準，尚未見在水產品中同時檢測5種硝基咪唑類藥物的報道。本實驗以固相萃取法為凈化手段，采用液相色譜-紫外檢測技術，建立測定羅非魚肌肉中硝基咪唑類多組分殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑、洛硝噠唑標準品(純度均為99.0%) 美國Sigma公司；乙腈、甲醇(均為色譜純) 美國天地公司；其他試劑無特別說明均為分析純；水為超純水。

1100高效液相色譜儀(配紫外檢測器) 美國Agilent公司；組織勻漿機 江蘇國華公司；旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司；恒溫振蕩器 金壇市富華儀器有限公司；DK-S24型恒溫水浴鍋 上海森信儀器公司；氮吹儀 美國Organomation公司；Oasis MCX固相萃取柱(3CC) 美國Waters公司；純水過濾裝置 法國Millipore公司。1.2 方法

1.2.1 醋酸緩沖液的配制

稱取0.82g無水醋酸鈉溶解于800mL水中，以冰醋酸調節pH4.3，加水定容至1000mL。

1.2.2 濃氨水甲醇溶液的配制

準確移取2mL濃氨水，用甲醇定容到100mL。1.2.3 標準品溶液的制備

稱取甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑、洛硝噠唑標準品各10.0mg，混合后用甲醇溶解并定容到100mL，質量濃度為100μg/mL的混合標準貯備液(冷藏保存，可保存6個月)；標準工作液：臨用時準確移取貯備液，用流動相稀釋，配制成系列質量濃度的標準工作液。1.2.4 樣品前處理

準確稱取10.00g肌肉，放到組織搗碎機中，加入2.0g氯化鈉和2.0g磷酸氫二鉀，均質，加入20.0mL乙酸乙酯，40℃振蕩提取60.0min，過濾，用20.0mL乙酸乙酯重復提取，合并濾液，在旋轉蒸發儀濃縮至干。

用1mL 1.0moL/L鹽酸和1.5mL乙酸乙酯洗滌旋發瓶，轉移到20.0mL的分液漏斗，重復用1mL 1.0moL/L鹽酸和1.0mL乙酸乙酯洗滌，一起轉移到分液漏斗，加入5.0mL正己烷，振蕩，靜置30min，收集下層。樣品過MCX柱(預先用2.0mL甲醇、2.0mL水沖洗)，讓樣品在自然重力下流出，吹干，加3.0mL水洗柱，加3.0mL體積分數2%的濃氨水-甲醇溶液進行洗脫，收集洗脫液，水浴40℃以氮氣吹至0.5mL，用流動相定容至1.0mL，經過0.45μm濾膜過濾后，供液相色譜測定。

1.2.5 色譜條件

色譜柱為HC C18柱(250×4.6mm，5μm)；流動相為醋酸緩沖液-乙腈(86:14，V/V)，使用前以0.45μm濾膜過濾，并超聲脫氣；流速1.0mL/min；色譜柱溫30℃；進樣量30μL；檢測波長320nm。當樣品圖譜和標準品色譜峰保留時間一致時，采用DAD對該色譜峰進行紫外光譜特征掃描，作為定性的依據，以避免假陽性結果的出現。

2 結果與分析

2.1 提取液的選擇

由于硝基咪唑類藥物具有兩性性質，即在弱堿性條件下呈游離分子狀態，在弱酸性條件下質子化，因此加入磷酸氫二鉀使溶液呈弱堿性，以便于加硝基咪唑類物質完全從樣品中提取出來[7,11]。國內外文獻報道中多使用二氯甲烷、乙腈和乙酸乙酯作為提取溶劑[8-10]。本實驗對比了該3種提取液的提取效果，發現針對提取樣品中甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑、洛硝噠唑5種成分的回收率，乙酸乙酯依次高于乙腈和二氯甲烷，二氯甲烷、乙腈提取液中雜質含量明顯高于乙酸乙酯，乙腈去蛋白效果好，但乙腈與水互溶，進一步萃取時乳化現象較嚴重，且乙腈沸點較高，提取后不容易蒸干濃縮。采用乙酸乙酯提取動物肌肉組織中的硝基咪唑類藥物，在提取液中加磷酸氫二鉀，使溶液呈弱堿性，加入氯化鈉，其鹽析作用可以提高回收率。2.2 凈化條件的選擇

萃取樣品的乙酸乙酯液中含有較低極性的雜質，如蛋白質、脂肪等脂溶性物質，液-液萃取時容易乳化，因此考慮采用固相萃取法凈化樣品。因此選用HLB、C18、MCX三種不同填料的萃取小柱，比較回收率和峰型圖(圖1)可以看出。使用MCX柱時不僅峰形好而且5種硝基咪唑類藥物的回收率均較高。

圖1 使用MCX柱凈化羅非魚樣品中添加硝基咪唑類藥物色譜圖Fig.1 Chromatogram of nitroimidazoles in tilapia muscle samples using MCX SPE

離子交換固定相上組分的保留和洗脫主要決定于流動相中的離子強度、反離子強度和pH值，與溶劑強度關系較小[1]。國內外報道中，分析硝基咪唑類藥物使用了很多類型填料的固相萃取柱[7,11]。硝基咪唑類藥物為弱堿性藥物，可在陽離子交換柱上有效保留，所以本實驗選擇強陽離子交換樹脂固相萃取柱(MCX柱)凈化。

在羅非魚空白樣品中添加標準品2.0μg/kg時，采用乙腈、甲醇、體積分數2%的濃氨水甲醇3種不同的洗脫液計算回收率。結果顯示，2%濃氨水-甲醇溶液做洗脫液時，甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑、洛硝噠唑的回收率均比乙腈和甲醇高，分別為73.3%、74.7%、62.9%、74.4%、80.1%。所以確定洗脫液為2%濃氨水-甲醇溶液。

通過不同體積洗脫液比較硝基咪唑類藥物的回收率。洗脫液體積為3～5mL時，硝基咪唑類藥物的回收率相差不多，考慮到后續的氮吹過程中洗脫液體積較少較節約時間，故確定洗脫液的體積為3mL。

2.3 色譜條件的選擇

高效液相色譜法檢測微量藥物的分離條件不僅要求盡量將組分分開，而且還要求色譜峰與雜質峰盡量分開。國內外檢測硝基咪唑的流動相多采乙腈-水或甲醇-水。本實驗嘗試甲醇-水、乙腈-水等流動相體系，但峰型不理想，因此選用醋酸氨緩沖液:乙腈比例為86:14 (V/V)，此時雜質峰和溶劑峰在組分出峰時間之前均已出峰，因此這個流動相比例是較為合理的。

5種組分的紫外最大吸收波長略有差異，考慮到色譜峰中雜質干擾問題，紫外檢測波長越大雜質干擾越少，經過全波長掃描確定紫外檢測波長為320nm。

2.4 線性、重現性、檢出限和回收率

配制硝基咪唑類混標的系列標準工作液分別為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0μg/mL，每一質量濃度重復3次，按上述液相色譜條件分析，測出對應質量濃度的峰面積作標準曲線，得回歸方程和相關系數。結果顯示，樣品濃度在15.0～750.0μg/kg范圍內，各組分含量(X)和峰面積(Y)有良好的線性關系，標準校準工作曲線的相關系數均能達到0.99以上。

將標準品配制成質量濃度較低的一組溶液，對每個質量濃度樣品測定3次，記錄并計算每次測得的信號強度與背景信號強度的均值，以能達到RSN≥3時的樣品質量濃度為標準樣品溶液的最低檢測限，以能達到RSN≥10時樣品的質量濃度為標準樣品溶液的最低定量限。對羅非魚空白樣品中以1.0μg/kg加標進行實驗，各色譜峰明顯，計算RSN在11.6～34.3之間。因此把此質量濃度作為最小檢出質量濃度。

在10.0g羅非魚空白樣品中加入適量的標準溶液，制備陽性樣品。按1.2.4節方法提取凈化后液相色譜檢測。1d內每一水平重復3個樣品，取平均值，計算日內平均回收率及標準相對偏差，結果見表1。

表1 羅非魚中添加不同水平硝基咪唑類藥物的回收率(n=3)Table 1 Recoveries of 5 nitroimidazoles from tilapia muscle at different spike levels (n = 3)

3 結 論

采用固相萃取-高效液相色譜法同時測定羅非魚肌肉中甲硝唑、地美硝唑、奧硝唑、替硝唑、洛硝噠唑5種殘留量，方法檢出限均以達到1.0μg/kg。該方法操作方便、靈敏度高、準確度和精密度均可以滿足水產品中硝基咪唑類殘留檢測分析的需要。

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Simultaneous Determination of Nitroimidazoles Multi-residues in Tilapia Muscle by High Performance Liquid Chromatography

WANG Yang，ZHENG Chong-ying，HE Feng，YE Lei-hai
(Aquatic Product Quality Testing Center of Zhejiang Province, Hangzhou 310012, China)

A high-performance liquid chromatography (HPLC) method was developed for the simultaneous analysis of 5 nitroimidazole multi-residues (metronidazole, dimetridazole, ornidazole, tinidazole and ronidazole) in tilapia muscle tissues. Samples were homogenized and extracted by added sodium chloride, monopotassium phosphate and ethyl acetate. Afterwards, the organic phase was recovered and condensed. Finally, the residue was dissolved in hydrochloric acid/ethyl acetate, defatted by liquid-liquid extraction with addedn-hexane, cleaned up on an MCX column by elution with 2% ammonia/methanol, separated chromatographically using acetate buffer solution/acetonitrile (86:14,V/V) as the mobile phase and detected at 320 nm. The results revealed that the limits of detection for 5 nitroimidazoles were all 1.0 μg/kg. The average recoveries for metronidazole, dimetridazole, ornidazole, tinidazole and ronidazole at the spike level of 2.0 μg/kg were 73.3%%, 74.7%, 62.9%, 74.4% and 80.1%, respectively with a RSD of less than 10% (n= 3). This method is simple, sensitive, accurate, precise, and in line with the requirements the Ministry of Agriculture for veterinary drug residue analysis.

solid phase extraction；high performance liquid chromatography (HPLC)；tilapia；nitroimidazoles

TS207.3；O657

A

1002-6630(2011)20-0197-03

2011-02-28

浙江省科技廳水產品加工產業創新團隊課題(2011R09031-10)

王揚(1973—)，女，高級工程師，碩士，主要從事水產品營養質量檢測和安全評價研究。E-mail：wangyangruanfeng@163.com