熒光染料E MA在實(shí)時(shí)熒光P C R定量檢測海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌活細(xì)胞中的應(yīng)用

祝儒剛

(遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，遼寧 沈陽 110036)

熒光染料E MA在實(shí)時(shí)熒光P C R定量檢測海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌活細(xì)胞中的應(yīng)用

祝儒剛

(遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，遼寧 沈陽 110036)

將熒光染料——疊氮溴乙錠(ethidium bromide monoazide，EMA)與實(shí)時(shí)熒光-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)相結(jié)合，對(duì)其在RT-PCR定量檢測海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌活細(xì)胞中的應(yīng)用進(jìn)行研究。純培養(yǎng)條件下，在2.2×102～2.2×107CFU范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)的常用對(duì)數(shù)值與Ct值之間呈嚴(yán)格的負(fù)相關(guān)性，并且不添加EMA時(shí)的檢測靈敏度(22CFU)略大于添加EMA(2.2×102CFU)時(shí)的檢測靈敏度；人工污染牡蠣樣品，利用RT-PCR和EMA RT-PCR以及平板計(jì)數(shù)法分別進(jìn)行副溶血弧菌定量檢測，結(jié)果表明EMA RT-PCR更接近于平板計(jì)數(shù)的結(jié)果，單純RT-PCR定量的結(jié)果偏大；在采集的45份海產(chǎn)品樣品中，不經(jīng)富集培養(yǎng)，利用EMA RT-PCR方法僅有一份牡蠣樣品呈陽性，牡蠣樣品污染程度為114CFU/g。該方法能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地進(jìn)行海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌活細(xì)胞的定量檢測，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

疊氮溴乙錠(EMA)；實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)；海產(chǎn)品；活細(xì)胞；副溶血弧菌檢測

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是水產(chǎn)品中引起食物中毒的重要病原菌之一，在海產(chǎn)品中的攜帶率高達(dá)4 5.7%，其中牡蠣、毛蚶、泥螺、扇貝、龍蝦、蟹、章魚、蛤、鱈是副溶血性弧菌的主要侵染對(duì)象。目前，副溶血弧菌引起食物中毒的發(fā)生規(guī)模以及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢，已成為我國首要的食源性致病菌[1-3]。

近年來，一些基因水平的檢測方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法和實(shí)時(shí)熒光PCR(real-time PCR，RT-PCR)方法，由于在檢測病原菌方面快速、高靈敏度和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)顯示出長遠(yuǎn)的發(fā)展前景。然而，在食品檢測方面，死菌DNA長期存在使基因水平的檢測方法高估了樣品中活菌的水平，有時(shí)甚至出現(xiàn)檢測的假陽性結(jié)果。熒光染料疊氮溴乙錠(ethidium bromide monoazide，EMA)能選擇性抑制死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增，而對(duì)活細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增幾乎沒有影響。因此，EMA與RT-PCR技術(shù)相結(jié)合，能更加準(zhǔn)確地檢測出樣品中活菌細(xì)胞的存在[4-9]。

目前，關(guān)于EMA與實(shí)時(shí)RT-PCR相結(jié)合定量檢測食品中致病菌活細(xì)胞的報(bào)道非常少，僅有創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌[10-12]。已有的報(bào)道也只是對(duì)EMA應(yīng)用于RTPCR的條件進(jìn)行摸索，以及對(duì)EMA區(qū)分鑒別死活細(xì)胞的能力進(jìn)行證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)在證實(shí)EMA可區(qū)分鑒別死活細(xì)胞的基礎(chǔ)上，著重研究其在RT-PCR定量檢測海產(chǎn)品中副溶血弧菌活細(xì)胞中的應(yīng)用，具有普遍應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

扇貝、牡蠣、毛蚶樣品(各15份，每種海產(chǎn)品中8份來自海鮮批發(fā)市場、7份來自零售早市)；標(biāo)準(zhǔn)菌株、副溶血弧菌ATCC17802 本實(shí)驗(yàn)室保存。

EMA 美國Sigma公司；LightCyclerOR480 SYBR GreenⅠ(cat. no.04707516001)羅氏熒光染料試劑盒 德國Roche Diagnostics公司；EZ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程(上海)有限公司；胰胨肉湯(蛋白胨2%、NaCl 4%、0.01%的結(jié)晶紫溶液0.5%、pH9.0)、T1N3(1%蛋白胨、3% NaCl、2%瓊脂)瓊脂。

LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 德國Roche Diagnostics公司；Stomacher 400型高效自動(dòng)均質(zhì)器 英國Seward公司；752N紫外-可見分光光度計(jì) 西安明克斯檢測設(shè)備有限公司；鹵鎢燈(500W)。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)及活細(xì)胞熱致死時(shí)間確定

副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802經(jīng)活化后轉(zhuǎn)接胰胨肉湯液體培養(yǎng)基，37℃、150r/min條件下過夜培養(yǎng)。收集菌體，經(jīng)0.85%滅菌生理鹽水洗滌兩次后，重懸于生理鹽水中。取定量菌懸液梯度稀釋，測定每個(gè)梯度的OD600nm并涂T1N3瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)48h后測定活菌數(shù)。以活菌數(shù)(x軸)和OD600nm值(y軸)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且在本實(shí)驗(yàn)中，均以此標(biāo)準(zhǔn)曲線調(diào)整菌液濃度[12]。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)[13-15]。

取上述經(jīng)洗滌的菌懸液，調(diào)整其濃度為4×108CFU/ mL，分別取0.5mL于1.5mL離心管中，95℃水浴加熱，每隔30s取樣涂平板，37℃過夜培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均數(shù)。

1.3 EMA抑制熱致死副溶血弧菌細(xì)胞DNA RT-PCR擴(kuò)增能力測定

經(jīng)0.85%滅菌生理鹽水洗滌的菌懸液，調(diào)整濃度后分別取0.5mL轉(zhuǎn)移至完全相同的5個(gè)離心管，每管內(nèi)活細(xì)胞數(shù)分別達(dá)到2×107、2×106、2×105、2×104、2×103CFU。95℃水浴加熱10min活細(xì)胞致死處理后，冷卻至室溫。另一組實(shí)驗(yàn)，同樣準(zhǔn)備5個(gè)完全一樣的離心管，每個(gè)離心管裝0.5mL菌懸液，活細(xì)胞數(shù)分別達(dá)到2×107、2×106、2×105、2×104、2×103CFU，不經(jīng)過水浴加熱活細(xì)胞致死處理。0.5mL滅菌生理鹽水而不含副溶血弧菌細(xì)胞的離心管作為陰性對(duì)照[16-17]。

向兩組實(shí)驗(yàn)菌懸液中分別加入0.1mg/mL的EMA，使EMA終質(zhì)量濃度均達(dá)到1.0μg/mL。將菌懸液在黑暗處室溫放置5min，然后將離心管開蓋放置冰上，在距離燈管16cm處曝光20min。曝光后的混合菌懸液在10000r/min離心5min，收集菌體。倒掉上清液后將菌體重懸在0.5mL生理鹽水中，10000r/min再次離心5min，收集菌體，倒掉上清液，再次重懸于0.5mL生理鹽水中，裂解法提取DNA后用于RT-PCR[18-19]。

1.4 DNA模板制備[20]

用TZ裂解液(2.0% Triton X-100、2.5mg/mL的疊氮化鈉、0.1mol/L Tris-HCl緩沖液、pH8.0)提取模板DNA。經(jīng)EMA處理曝光后的菌懸液與等體積的2×TZ裂解液混勻，沸水浴10min后冷卻至室溫，10000r/min離心10min去掉菌體碎片沉淀，取上清液直接用作RT-PCR模板。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌(ATCC 17802)菌懸液，菌體用滅菌生理鹽水洗滌兩次，調(diào)整菌懸液濃度約為4× 108CFU/mL。10倍梯度稀釋，得到菌濃度范圍4×107～4CFU/mL。

完全一樣的兩組實(shí)驗(yàn)，向每組8個(gè)完全相同的離心管內(nèi)分別加入0.5mL菌懸液，每管細(xì)胞數(shù)分別為2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2× 101、2CFU。其中一組分別加入0.1mg/mL EMA，使EMA終質(zhì)量濃度均達(dá)到1.0μg/mL，然后如上進(jìn)行曝光處理；另一組不添加EMA。0.5mL滅菌生理鹽水而不含副溶血弧菌細(xì)胞的離心管作為陰性對(duì)照。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。兩組實(shí)驗(yàn)離心收集菌體后，用柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒抽提DNA，溶于20μL滅菌水中備用[21-23]。

每個(gè)稀釋度精確的活菌數(shù)通過取其中一個(gè)稀釋度的菌懸液涂T1N3瓊脂平板后，37℃培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)獲得。

1.6 人工污染牡蠣組織中致病性副溶血弧菌細(xì)胞的RTPCR和EMA RT-PCR定量檢測

調(diào)整菌懸液濃度約為4×108CFU/mL，10倍梯度稀釋，得到菌濃度范圍4×108～4×103CFU/mL。

牡蠣樣品來自當(dāng)?shù)睾．a(chǎn)品零售市場，在無菌均質(zhì)袋內(nèi)，無菌操作剪碎5g樣品于44mL滅菌胰胨肉湯液體培養(yǎng)基，利用高效自動(dòng)均質(zhì)器均質(zhì)，無菌操作每個(gè)濃度水平取1mL分別接種，混勻。

吸取每個(gè)樣品10mL，800r/min離心10min，除去牡蠣細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，10000r/min離心10min收集菌體，將菌體重懸于1mL滅菌生理鹽水中。一管用于平板計(jì)數(shù)，另一管分成兩個(gè)0.5mL，其中一個(gè)0.5mL經(jīng)EMA處理后用柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒抽提DNA用于RT-PCR定量，另一個(gè)0.5mL菌懸液不經(jīng)EMA處理直接抽提DNA用于RT-PCR定量[16]。

定量結(jié)果的表現(xiàn)形式為lg(CFU/g)(以牡蠣組織質(zhì)量計(jì))。將平板計(jì)數(shù)的結(jié)果與RT-PCR和EMA RT-PCR定量結(jié)果相比較。為確保牡蠣樣品不含trh陽性副溶血弧菌，取1g樣品加入50mL胰胨肉湯培養(yǎng)基中，37℃、150r/min過夜培養(yǎng)后，取菌液做RT-PCR鑒定。

1.7 海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌活細(xì)胞的定量檢測

最常見且最易被副溶血弧菌污染的扇貝、牡蠣、毛蚶樣品用專用的無菌采集袋采集，跟預(yù)先準(zhǔn)備好的冰袋一起迅速送回分析實(shí)驗(yàn)室，并在24h內(nèi)做分析處理。樣品經(jīng)去殼和除去雜質(zhì)處理后，無菌操作每份樣品取5g內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至45mL胰胨肉湯培養(yǎng)基中，在均質(zhì)袋內(nèi)用高效自動(dòng)均質(zhì)器均質(zhì)1min。吸取每個(gè)樣品10mL，800r/ min離心10min，除去細(xì)胞碎片，上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，10000r/min離心10min收集菌體。將菌體重懸于0.5mL無菌水中，添加EMA，使其終質(zhì)量濃度達(dá)到1.0μg/mL。將菌懸液在黑暗處室溫放置5min，然后將離心管開蓋放置冰上，在距離燈管16cm處曝光20min。曝光后的混合菌懸液10000r/min離心5min，收集菌體。倒掉上清液后將菌體重懸在0.5mL的無菌水中，10000r/ min再次離心5min，收集菌體，棄去上清液，再次重懸在50μL無菌水中[12]。利用柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒抽提DNA，溶于20μL滅菌水中備用。

1.8 引物及RT-PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。病原性副溶血弧菌致病基因trh檢測引物上游(P1)為：5′-TTGCTTTCAG TTTGCTATTGGCT-3′；下游引物(P2)為：5′-GCTAC TTTCTAGCATTTT CTCTGC-3′，擴(kuò)增片段長度為300bp。20μL的擴(kuò)增體系包括：10μL熒光染料混合液，5μL模板D N A，上下游引物各1μL(10μmol/L)、3μL PCR級(jí)無菌水。RT-PCR反應(yīng)體系：94℃預(yù)變性10min，35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃ 20s，55℃ 20s，72℃30s[12]。每個(gè)RT-PCR反應(yīng)重復(fù)3次，得到平均Ct值和標(biāo)準(zhǔn)背離值。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示具有差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血弧菌的熱致死時(shí)間

95℃水浴處理副溶血弧菌菌懸液(OD600nm為0.7，4×108CFU/mL)[12]，每隔30s取樣涂平板，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃過夜培養(yǎng)后觀察計(jì)數(shù)(圖1)。結(jié)果表明，隨著熱處理時(shí)間的增加，其平板菌落數(shù)逐漸減少，當(dāng)熱處理時(shí)間延長到9min時(shí)，副溶血弧菌已失活，平板上沒有菌落生長，平板計(jì)數(shù)為零。因此，為了確保所有副溶血弧菌完全被殺死，得到結(jié)果：將濃度為4× 108CFU/mL的副溶血弧菌菌懸液在95℃水浴處理10min，所有副溶血弧菌細(xì)胞都已經(jīng)殺死，平板計(jì)數(shù)為零。

圖1 不同加熱時(shí)間處理后的副溶血弧菌活細(xì)胞數(shù)Fig.1 Viable cell counts of Vibrio parahaemolyticus during thermal treatment

2.2 EMA抑制熱致死副溶血弧菌細(xì)胞DNA RT-PCR擴(kuò)增

經(jīng)EMA處理，當(dāng)活細(xì)胞數(shù)由2×107減少到2×103時(shí)，Ct值從18.52±0.52線性增大到27.49±0.41；同樣經(jīng)EMA處理的熱致死細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞數(shù)由2×107CFU/g減少到2×103CFU/g時(shí)，對(duì)應(yīng)RT-PCR的Ct值從28.8±0.41 變化至30.21±0.39，此時(shí)陰性對(duì)照(無細(xì)菌細(xì)胞)的Ct值為30.5±0.70(圖2)。這表明，對(duì)熱致死細(xì)胞來說，EMA完全有效地抑制了其DNA的RT-PCR擴(kuò)增，在R T-PCR擴(kuò)增體系中，幾乎不存在可擴(kuò)增的DNA，因此其Ct值與陰性對(duì)照的Ct值無顯著差異(P＞0.05)；而EMA對(duì)活細(xì)胞DNA的RT-PCR擴(kuò)增幾乎沒有影響，隨著細(xì)胞數(shù)的減少，Ct值逐漸增大，各Ct值與陰性對(duì)照均存在顯著差異(P＜0.05)。

圖2 EMA抑制熱致死細(xì)胞DNA RT-PCR擴(kuò)增能力Fig.2 Inhibitory effect of EMA on RT-PCR amplification of DNA from thermally inactivated Vibrio parahaemolyticus cells

2.3 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 添加和不添加EMA樣品的Ct值與菌落數(shù)關(guān)系Table 1 Relationship between CFU and Ct value of samples with and without EMA treatment

圖3 添加和不添加EMA情況下細(xì)胞常用對(duì)數(shù)值與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curves between Log CFU and Ct with and without the addition of EMA

理論上，基于已知的細(xì)胞數(shù)量和對(duì)應(yīng)Ct值所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以通過RT-PCR對(duì)不同來源樣品中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于RT-PCR(22×107～2.2× 107CFU范圍內(nèi))和EMA RT-PCR(2.2×102～2.2×107CFU范圍內(nèi))，Ct值與細(xì)胞對(duì)數(shù)之間具有非常好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為0.9883和0.9987。相同條件下，RTPCR的檢測靈敏度高于EMA RT-PCR的靈敏度，分別為22CFU和2.2×102CFU。并且，相同細(xì)胞濃度下，EMA RT-PCR的Ct值大于RT-PCR約1～2個(gè)循環(huán)(表1、圖3)。陰性對(duì)照沒有檢測到副溶血弧菌細(xì)胞存在。本研究的隨后實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，對(duì)于經(jīng)EMA或不經(jīng)EMA處理的樣品，均用此標(biāo)準(zhǔn)曲線來對(duì)樣品中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行定量。

2.4 人工污染牡蠣組織中致病性副溶血弧菌RT-PCR和EMA RT-PCR定量檢測與平板計(jì)數(shù)比較

分別用RT-PCR、EMA RT-PCR和平板計(jì)數(shù)法對(duì)6個(gè)稀釋梯度的人工污染牡蠣組織中的總致病性副溶血弧菌進(jìn)行定量。RT-PCR和EMA RT-PCR的定量Ct值通過圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出lg(CFU/g)，結(jié)果如表2所示。總體來說，RT-PCR和EMA RT-PCR的定量結(jié)果與平板計(jì)數(shù)的結(jié)果均非常接近，其中EMA RT-PCR的定量結(jié)果更接近于平板計(jì)數(shù)的結(jié)果，略為偏低；而RT-PCR的定量結(jié)果偏離平板計(jì)數(shù)的結(jié)果稍大一些，大于EMA RT-PCR和平板計(jì)數(shù)的結(jié)果(P＜0.05)。由于檢測靈敏度的關(guān)系，EMA RT-PCR沒有檢測出4×103CFU/mL污染梯度樣品中的副溶血弧菌。這表明，EMA RT-PCR技術(shù)可以代替平板計(jì)數(shù)的方法定量檢測海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌活細(xì)胞，可以大大縮短定量時(shí)間。

表2 RT-PCR、EMA RT-PCR和平板計(jì)數(shù)法測定人工污染牡蠣中細(xì)菌總數(shù)的比較Table 2 Comparison of total bacterial counts in artificially contaminated oyster determined by RT-PCR, EMA RT-PCR and plate count methods

2.5 實(shí)際海產(chǎn)品樣品中致病性副溶血弧菌活細(xì)胞檢測

利用EMA RT-PCR技術(shù)對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行定量檢測。結(jié)果表明，15份牡蠣樣品中，一份樣品呈致病性副溶血弧菌陽性，樣品采自零售早市，含菌量為114CFU/g，其余未檢出致病性副溶血弧菌的樣品經(jīng)6h富集培養(yǎng)后，又有一份零售早市樣品呈陽性，富集后的菌濃度為2.8× 103CFU/mL。富集前，15份扇貝和15份毛蚶均為致病性副溶血弧菌陰性；經(jīng)6h富集培養(yǎng)后，兩份毛蚶和一份扇貝檢測出致病性副溶血弧菌陽性，一份毛蚶來自海鮮批發(fā)市場、一份來自零售早市，富集后的菌濃度分別為3.7×103、2.5×103CFU/mL，陽性扇貝樣品也采自零售早市，富集后的菌濃度為2.9×103CFU/mL。

3 討 論

EMA能滲透到細(xì)胞壁或細(xì)胞膜不完整的死細(xì)胞體內(nèi)并插入DNA共價(jià)結(jié)合，隨后基于DNA的PCR檢測方法就不能擴(kuò)增死細(xì)胞DNA；而活細(xì)胞的完整細(xì)胞壁、活細(xì)胞膜能夠阻止EMA滲透到菌體內(nèi)與DNA共價(jià)結(jié)合，因而其PCR擴(kuò)增不受影響。EMA的這種性質(zhì)為PCR方法檢測區(qū)分海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌死活細(xì)胞提供了可靠的方法依據(jù)。傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法能定量檢測活細(xì)胞，但是所需時(shí)間較長，而單獨(dú)的RT-PCR也只能定量檢測總的細(xì)胞數(shù)，而將EMA與RT-PCR結(jié)合則能夠準(zhǔn)確檢測出存活于海產(chǎn)品中的致病性副溶血弧菌，并且定量檢測可在4h內(nèi)完成，大大縮短了定量的時(shí)間[24]。

添加和不添加EMA情況下Ct值與細(xì)胞數(shù)常用對(duì)數(shù)值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，Ct值與細(xì)胞數(shù)常用對(duì)數(shù)值之間存在嚴(yán)格的負(fù)相關(guān)性，添加EMA和不添加EMA時(shí)的相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.9987和0.9883。并且添加EMA時(shí)的檢測靈敏度低于不添加EMA的靈敏度，兩者分別為2.2× 102CFU和22CFU，這表明EMA的添加會(huì)對(duì)檢測的靈敏度有一些影響，這可能是由于高濃度的EMA也會(huì)對(duì)少量活細(xì)胞DNA的擴(kuò)增有影響所致。這一點(diǎn)在對(duì)比RTPCR和EMA RT-PCR方法對(duì)人工污染牡蠣樣品中致病性副溶血弧菌的定量檢測時(shí)也有所體現(xiàn)，相同的人工污染副溶血弧菌濃度條件下，EMA RT-PCR定量的結(jié)果最小，平板計(jì)數(shù)的結(jié)果居中，普通EMA RT-PCR的結(jié)果最大(P＜0.05)[25-27]。

從采集的45份海產(chǎn)品樣品的檢測結(jié)果可以看出，零售早市采集的樣品污染致病性副溶血弧菌的幾率高于從各大海鮮批發(fā)市場采集的樣品，這跟海產(chǎn)品所處的環(huán)境以及新鮮程度有很大關(guān)系。

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Application of Ethidium Bromide Monoazide for Quantification of Pathogenic Viable Cells ofVibrio parahaemolyticusin Seafood Using Real-time Polymerase Chain Reaction

ZHU Ru-gang
(Engineering Technology Research Center for Food Biology Processing of Liaoning Province, College of Light Industry, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

The pathogenic viable cells ofVibrio parahaemolyticusin seafood were detected using real-time polymerase chain reaction combined with ethidium bromide monoazide (EMA) dye. For pure culture, there was a negative correlation between the log number of cells and the associated Ct value in the range of 2.2 × 102to 2.2 × 107CFU, and the detection sensitivity of single RT-PCR (22 CFU) was slightly higher than that of EMA RT-PCR(2.2×102CFU). For artificially contaminated oyster samples, similar results were obtained from EMA RT-PCR and plate count method, and slightly lower results from single RT-PCR. Without enrichment, only one positive sample was detected in forty-five seafood samples by EMA RT-PCR with a viableVibrio parahaemolyticuscell of 114 CFU/g. In conclusion, EMA RT-PCR could provide a rapid, sensitive and accurate way for the quantitative detection ofVibrio parahaemolyticusin seafood.

ethidium bromide monoazide (EMA)；real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)；seafood；viable cells；Vibrio parahaemolyticusdetection

TS201.6

A

1002-6630(2011)20-0206-05

2010-12-02

遼寧大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目(2009LDQN21)

祝儒剛(1980—)，男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c分子生物學(xué)。E-mail：zrg_luck@163.com