利用冷榨花生餅制備花生多肽飲料

胡志和，郭 嘉

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

利用冷榨花生餅制備花生多肽飲料

胡志和，郭 嘉

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

以冷榨花生餅為原料，采用堿法和酶水解法制備花生蛋白，以蛋白質提取率為指標，確定蛋白提取條件，并利用所提取蛋白或蛋白水解物經乳酸菌發酵制備花生多肽飲料。結果表明NaOH溶液提取花生蛋白的最佳條件為：pH9.0、溫度55℃、料液比1:8(g/mL)、浸提2h，蛋白提取率80.68%；胰蛋白酶水解蛋白的最佳條件為：酶與底物比1:50(m/m)、底物質量濃度5g/100mL、pH9.0、水解溫度50℃，蛋白提取率96.26%。以花生水解蛋白和脫鹽乳清粉為原料，采用直投式乳酸菌為發酵劑，發酵條件為：花生水解蛋白質量濃度2g/100mL、乳清粉加入量1g/100mL、發酵劑與發酵液比1:25(g/kg)、42℃發酵5h、4℃后熟15h、蔗糖質量分數9%時的口感最佳。

冷榨花生餅；花生蛋白；花生多肽；乳酸發酵飲料

我國花生年產量為500～650萬噸，榨油后產生的花生餅粕150多萬噸?；ㄉ炂纱值鞍踪|含量為40%～80%，是非常值得開發的植物蛋白資源。對花生蛋白的提取及其功能性質的研究已有文獻報道[1-4]。由于壓榨造成花生餅粕中蛋白的變性，造成花生蛋白提取方面的困難，以及壓榨造成餅粕氨基酸組成變化，使其營養價值降低，也是影響其開發利用的原因之一。利用酶法直接水解花生餅粕或采用堿提蛋白后水解制備多肽，是目前利用花生餅粕的趨勢之一。利用酶水解花生蛋白制備花生多肽的已有文獻報道[5-8]，本實驗以冷榨花生餅粕為原料，采用NaOH溶液提取蛋白和胰蛋白酶水解花生餅粕提取蛋白水解物，以蛋白提取率為指標比較提取效果。對提取蛋白或水解物采用乳酸菌發酵法制備乳酸發酵飲料，通過乳酸菌發酵，不僅能夠產生生理活性成分，還能改善產品風味[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷榨油后的花生餅粕 河北唐山糧油食品有限公司；胰蛋白酶(250U/mg) 美國Sigma公司；DEMI90脫鹽乳清粉 芬蘭維利奧有限公司；YF-L812直投式發酵劑 丹麥漢森公司；所用化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

EMS-8A型恒溫磁力攪拌器 天津歐諾儀器有限公司；KDN-2C型凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋、LRH-70型生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；DH-101型電熱恒溫鼓風干燥箱 天津中環實驗電爐有限公司； Scientz-50N型冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型臺式離心機 美國Sigama公司；PB-10數字pH計 德國賽多利斯公司；SW-CJ-1F型潔凈工作臺 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

1.3.1.1 主要成分分析

水分含量的測定：GB 5009.3—2010《食品中水分的測定方法：直接干燥法》。蛋白質含量測定：G B 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定：凱式定氮法》。脂肪含量測定：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定：索氏提取法》。淀粉含量測定：GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定：酸水解法》。

1.3.1.2 蛋白質提取率的計算比例加入蒸餾水，用1mol/LNaOH溶液調pH值，保溫浸提2h后，浸提液4000r/min，離心30min，取上清液倒入已質量恒定的小燒杯中，按照GB 5009.3—2010方法于95～105℃干燥至質量恒定。

1.3.2.2 冷榨花生餅粕蛋白堿提條件優化

選取pH值(A)、溫度(B)和料液比(C)三因素三水平進行堿提工藝正交試驗，參考文獻[7]冷榨花生餅粕堿提工藝，并加以修改，以蛋白質提取率為考察指標，進行L9(33)正交試驗。各因素與水平設計見表1。

表1 堿提工藝提取花生蛋白正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design for optimizing alkaline extraction of peanut protein

1.3.1.3 水解度(degree of hydrolysis，DH)測定

DH測定采用pH-stat法[10-12]。

式中：DH為水解度/%；VNaOH為堿液體積/mL；CNaOH為堿液濃度/(mol/L)；α為氨基的解離度，α= [10(pH-pK)]/[1＋10(pH-pK)]，其中pK值為a-氨基酸的平均pK值，取7.0、pH為反應一開始體系的pH值；mp為底物中蛋白質總質量/g；htot為底物蛋白質所含肽鍵總數/ (mmol/g)，對于花生蛋白來說，htot＝7.13(根據花生蛋白的氨基酸組成計算得到)。

1.3.2 利用堿提工藝從冷榨花生餅粕中提取花生蛋白1.3.2.1 堿提花生蛋白工藝

將冷榨油后的花生餅粕粉碎，過40目篩，按一定

1.3.3 利用胰蛋白酶水解提取花生多肽

1.3.3.1 酶法提取制備花生蛋白多肽工藝[13-14]

花生餅粕粉碎→加水配成一定的底物質量濃度→調pH9→加熱處理(100℃，10min)→冷卻→酶解→滅酶(100℃，10min)→冷卻→離心(4000r/min，40min)→上清液→超濾(截留分子量10kD)→冷凍干燥→花生水解蛋白肽

1.3.3.2 胰蛋白酶水解花生餅粕單因素試驗

在底物質量濃度7g/100mL，溫度45℃以及pH8.0的條件下進行不同酶與底物比的水解，酶與底物比(m/m)分別取1:100、1:200、1:400；在酶與底物比為1:100，溫度45℃時，pH8.0的條件下進行不同底物質量濃度的水解，底物質量濃度分別取4、7、10g/100mL；在酶與底物比為1:100，底物質量濃度7g/100mL，pH8.0的條件下進行不同溫度的水解，溫度分別取40、45、50℃；在酶與底物比為1:100，底物質量濃度7g/100mL，溫度45℃的條件下進行不同pH值的水解，分別取pH7.0、8.0、9.0。

水解過程及水解產物的處理按1.4.3.1節方法進行，測定其蛋白質含量并計算出水解度。

1.3.3.3 胰蛋白酶水解花生餅粕粉條件優化

根據單因素試驗結果，以酶與底物比、底物質量濃度、溫度和pH值為影響因素，以蛋白質提取率為考察指標，進行L9(34)正交試驗。各因素水平設計見表2。

1.3.4 花生多肽飲料研制

1.3.4.1 花生多肽飲料工藝條件

表2 胰蛋白酶水解冷榨花生餅正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels in orthogonal array design for optimizing enzymatic extraction of peanut protein

花生蛋白多肽粉→加水(配成一定的底物質量濃度)→加入脫鹽乳清粉→加熱滅菌(100℃，5min)→冷卻→接種→乳酸發酵→后發酵→調配→冷藏→成品

以1.3.3.3節優化條件制備花生蛋白水解液，調整至pH7.0，4000r/min離心40min，取上清液，經超濾后，進行冷凍干燥，將花生蛋白多肽溶解至一定底物質量濃度，加入一定量的乳清粉混合均勻，沸水浴滅菌5min，迅速冷卻，將直投式發酵劑按一定比例接種，攪拌均勻，在42℃下進行發酵，以pH值不再變化作為發酵終點，然后在4℃條件下后發酵15h。

1.3.4.2 制備花生多肽飲料的正交試驗

制備花生多肽飲料時，選取底物質量濃度(A)、乳清粉加入量(B)、發酵劑與發酵液比(C)三因素，各取三水平，按正交設計試驗方案，以感官評價評分為參考指標，進行L9(33)正交試驗。各因素與水平設計見表3。苦味、異味，評定分數標準采用1～7分制，分別對應很差、差、較差、一般、較好、好、很好，評分方法見表4。

1.3.4.4 花生多肽飲料甜酸比調配

按照1.3.4.2節得出的最優條件制得的花生蛋白多肽發酵液，按照不同配比加入白砂糖，攪拌使其充分溶解，白砂糖的質量分數分別為8%、9%、10%，根據口感進行評比。

2 結果與分析

2.1 冷榨花生餅的主要成分

冷榨花生餅經測定分析，其蛋白質、脂肪、淀粉等主要成分含量見表5。

表5 冷榨花生餅的主要成分Table 5 Main components of cold pressed peanut cake

表3 制備花生多肽飲料L9(33)正交試驗因素水平表Table 3 Factors and levels in orthogonal array design for optimizing fermentation of hydrolyzed peanut protein and desalted whey powder

1.3.4.3 感官評價

表4 花生多肽飲料感官品質評分標準Table 4 Standards for sensory evaluation of peanut polypeptide beverage

2.2 堿法提取花生餅粕蛋白條件優化

根據方法1.3.2.2節設計，按表1進行正交試驗，得到堿提花生蛋白的試驗結果見表6。

表6 利用堿提工藝提取花生蛋白正交試驗設計及結果Table 6 Orthogonal array design and corresponding results foroptimizing alkaline extraction of peanut protein

感官評價的方法采用評分評價法，對花生發酵飲料感官進行綜合評分，評審項目包括香味、咸味、酸度、

由表6可知，通過對堿提工藝提取花生蛋白所得產物進行蛋白質含量測定，得出三種因素對蛋白質提取率結果影響大小依次為A＞B＞C，即pH值＞溫度＞料液比，最優組合為A2B3C2，即pH9.0、提取溫度55℃、料液比1:8。根據此條件進行驗證實驗，結果蛋白質提取率為80.68%。

2.3 胰蛋白酶水解花生餅粕蛋白制備多肽的條件確定

2.3.1 酶與底物比對花生蛋白提取率和水解度的影響

圖1 不同酶與底物比的水解進程曲線Fig. 1 Hydrolysis curves of cold pressed peanut cake at different levels of enzyme/substrate ratio

圖2 酶與底物比對花生蛋白提取率和水解度的影響Fig. 2 Effect of enzyme/substrate ratio on protein extraction rate and DH (degree of hydrolysis)

由圖1、2可知，酶與底物比越大，水解的速度越快，水解度越大，蛋白提取率越大，3種條件下水解時間為200min趨于水解完全。因此，酶與底物比1:100，水解200min水解效果較好。

2.3.2 底物質量濃度對蛋白提取率和水解度的影響

圖3 不同底物質量濃度的水解進程曲線Fig. 3 Hydrolysis curves of cold pressed peanut cake at different substrate concentrations

圖4 底物質量濃度對花生蛋白提取率和水解度的影響Fig. 4 Effect of substrate concentration on protein extraction rate and DH

由圖3、4可知，底物質量濃度對冷榨花生餅粕粉水解度影響不大，3種條件下水解200min水解趨于完全。在試驗范圍內，蛋白提取率隨底物質量濃度增而降低。

圖5 不同水解溫度的水解進程曲線Fig. 5 Hydrolysis curves of cold pressed peanut cake at different hydrolysis temperatures

2.3.3 溫度對蛋白提取率和水解度的影響

由圖5、6可知，在40、45、50℃條件下，水解200min水解趨于完全；隨著溫度的升高水解速度增快，水解度和蛋白提取率都增大。酶解溫度的高低與蛋白酶分子的穩定性密切相關，這是因為蛋白酶分子的肽鍵具有特定的空間結構，若反應溫度過低，則會大幅降低體系內分子運動的巨烈程度，以致降低蛋白酶與底物的碰撞機率；若反應溫度超過一定限度，極易引起次級鍵解離，從而致使蛋白酶喪失或部分喪失催化活性[15]。因此胰蛋白酶水解冷榨花生餅的較適溫度為50℃。

2.3.4 pH值對蛋白提取率和水解度的影響

圖7 不同pH值的水解進程曲線Fig. 7 Hydrolysis curves of cold pressed peanut cake at different levels of pH

圖8 pH值對花生蛋白提取率和水解度的影響Fig. 8 Effect of pH on protein extraction rate and DH

由圖7可知，3種pH值條件下水解200min趨于完成；由圖8可知，在試驗范圍內，隨著pH值的增大，蛋白的水解度和提取率隨著增大。

pH值對酶促反應的影響，主要體現在對酶活力的影響，pH值影響酶的活力的原因主要有3個方面：一是過酸或過堿可以破壞酶的空間結構，改變酶的構象，使酶的活性喪失；二是當pH值稍微變化時，酶雖未變性，但pH值可影響底物的解離狀態、也可影響酶分子活性部位上部分基團的解離，從而影響與底物的結合以及催化；三是pH值影響維持酶分子空間結構的有關基團解離，從而影響酶活性部位的構象，進而影響酶的活性[16-17]。

2.3.5 胰蛋白酶水解花生餅粕蛋白提取多肽的條件優化

根據方法1.4.3.3節正交因素水平表進行正交試驗，結果見表7。

由表7可知，通過對用胰蛋白酶水解冷榨花生餅所得到的花生水解蛋白和多肽粉進行蛋白質含量測定，得出三種因素對蛋白質提取率結果影響大小依次為A＞D＞C＞B，即酶與底物比＞底物質量濃度＞pH值＞溫度，最優組合為A1B2C2D1，即酶與底物比1:50、底物質量濃度5g/100mL、pH9、提取溫度50℃。根據此條件進行驗證實驗，結果蛋白質提取率為96.26%。

表7 胰蛋白酶水解冷榨花生餅正交試驗設計及結果Table 7 Orthogonal array design and corresponding results foroptimizing enzymatic extraction of peanut protein

2.4 制備花生多肽飲料

根據上述研究結果，選擇酶法水解花生餅粕，提取分離花生蛋白肽，用于乳酸發酵飲料的制作。

2.4.1 發酵過程中pH值的變化

花生多肽飲料發酵過程中體系pH值的變化如圖9所示。

圖9 發酵過程中花生多肽飲料體系pH值的變化Fig.9 Changes of pH of peanut polypeptides beverage system in fermentaion process

由圖9可知，當底物質量濃度、乳清粉加入量、發酵劑與發酵液比等因素不同(表8)，在42℃發酵，各樣品的發酵速度不同，產酸量也有差異，總體上，各因素水平下發酵時間在4～8h。結合對水解物的苦味和異味消減的評價(表8)可知，發酵速度快，產酸較多的樣品(樣品1、2、3、6)對苦味和異味的消減效果越好。2.4.2 花生發酵飲料的正交試驗結果

按1.3.4.2節試驗設計進行正交試驗，結果見表8。

表8 制備花生多肽飲料的正交試驗設計及結果Table 8 Orthogonal array design and corresponding results for optimizing fermentation of hydrolyzed peanut protein and desalted whey powder

由表8可知，通過對經發酵制得的花生多肽飲料進行感官評價，得出3種因素對產品品質影響的主次順序為A＞C＞B，即底物質量濃度＞發酵劑與發酵液比＞乳清粉的加入量，最優組合為A1B1C2，即底物質量濃度2g/100mL、乳清粉的加入量1%、發酵劑與發酵液比1:25(g/kg)、42℃發酵時間5h、4℃后熟15h，產品其感官評價相對較好。

2.4.3 花生多肽飲料最優甜酸比確定

經過后熟后的發酵液調整甜酸口味，確定蔗糖質量分數9%時的口感最佳，此產品具有濃郁的乳酸發酵香味，甜酸比適宜，無咸味、苦味和其他異味。

3 結 論

堿提花生蛋白優化的提取條件：pH9、提取溫度55℃、料液比1:8(m/m)、浸提2h，蛋白提取率80.68%。

用胰蛋白酶水解提取花生蛋白和多肽，取條件為：酶與底物比1:50(m/m)、底物質量濃度5g/100mL、pH9、提取溫度50℃、水解200min，蛋白提取率96.26%，水解度15.37%。

以花生多肽粉和脫鹽乳清粉為主要原料，乳酸發酵制備多肽飲料條件為：花生蛋白多肽濃度2g/100mL、乳清粉加入量1g/100mL、發酵劑與發酵液比1:25(g/kg)、42℃發酵時間5h、4℃后熟15h、蔗糖質量分數9%時的口感最佳。

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Preparation of Peanut Polypeptide Beverage Using Cold Pressed Peanut Cake

HU Zhi-he，GUO Jia
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

In this study, NaOH and trypsin were used to hydrolyze cold pressed peanut cake as a byproduct of the cold pressed extraction of peanut oil to obtain peanut protein. Orthogonal array design was employed to optimize the hydrolysis conditions of cold pressed peanut cake for maximum extraction efficiency of protein. The optimal NaOH treatment conditions were pH 9.0, 1:8 material/liquid ratio (g/mL), 8 ℃ extraction temperature, and 2 h extraction time, resulting in an extraction efficiency of 80.68%. The optimal trypsin treatment conditions were 1:50 enzyme/substrate ratio (m/m), 5 g/100 mL substrate concentration, pH 9.0 and 50 ℃ hydrolysis temperature, and the resulting extraction efficiency of protein 96.26%. The optimal conditions for fermentation of hydrolyzed peanut protein obtained using trypsin and desalted whey powder by direct vat set (DVS) lactic-acid bacteria starter for peanut polypeptide beverage with the best taste were hydrolyzed peanut protein amount 2 g/100 mL, desalted whey powder 1 g/100 mL, innoculum amount 1:25 (g/kg), fermentation at 42 ℃ for 5 h, post-aging for at 4 ℃ for 15 h and amount of sucrose addition in fermentation products 9%.

cold pressed peanut cake；peanut protein；peanut polypeptides；lactic acid bacteria-fermented beverage

TS275.4

B

1002-6630(2011)20-0335-06

2011-06-23

胡志和(1962—)，男，教授，碩士，研究方向為專用功能食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn