沙棗不同果、葉中多酚類物質抗氧化能力比較的研究

劉丹丹，李炳奇，陳韓英，童德軍，劉 紅，*

(1.石河子大學化學化工學院，新疆石河子832003; 2.石河子大學藥學院，新疆石河子832003; 3.石河子大學師范學院，新疆石河子832003)

沙棗不同果、葉中多酚類物質抗氧化能力比較的研究

劉丹丹1，李炳奇1，陳韓英2，童德軍3，劉 紅1，*

(1.石河子大學化學化工學院，新疆石河子832003; 2.石河子大學藥學院，新疆石河子832003; 3.石河子大學師范學院，新疆石河子832003)

采用丙酮溫浸法對尖果沙棗和大果沙棗果、葉中多酚物質進行提取并研究其抗氧化活性。通過測定不同材料多酚提取物對羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(·)以及2，2二苯代苦味肼基(DPPH·)的清除率，并利用硫代巴比妥酸法(TBA法)測定其對脂質過氧化的抑制作用。結果表明:八種實驗材料中，尖果沙棗青果和嫩葉多酚提取物對·OH·、DPPH·均具有較好的清除作用，且清除率均高于50%，同時對脂質過氧化的抑制作用明顯高于其余實驗材料。尖果沙棗較大果沙棗具有更好的體外抗氧化活性。

沙棗，多酚，自由基，抗氧化活性，TBA法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

尖果沙棗(Elaeagnus oxcarpa Schlecht.)和大果沙棗(Elaeagnus moorcroftii Wall ex Schlecht.)的青果、熟果、嫩葉、老葉 以上材料均采于野外，經生命科學學院閻平教授鑒定;丙酮、無水碳酸鈉、沒食子酸、Folin－酚、無水乙醇、Tris－HCl緩沖溶(pH=8.2)、鄰苯三酚、PBS磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、雙氧水、亞油酸、三氯乙酸、正丁醇、硫代巴比妥酸 以上所用試劑均為國產分析純; DPPH Sigma公司。

R－200旋轉蒸發器 瑞士BUCHI;SHZ－CB循環水真空泵 河南鞏義市英峪予華儀器廠;BS210電子天平 德國Sartorius公司;UV－2401PC型紫外分光光度計 日本島津公司;80－2低速臺式離心機江蘇省金壇市醫療儀器廠;B－260恒溫水浴鍋 上海安亭實驗儀器有限公司;DNP－5092電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙棗多酚含量的測定 多酚含量的測定采用福林－酚比色法(Folin－Ciocalteau)。準確稱取真空干燥至恒重的沒食子酸標準品44.3mg置于100mL棕色容量瓶中，用水溶解并定容至100mL，搖勻，作為對照品溶液。將配制好的沒食子酸溶液配成濃度為4.43、8.86、17.72、35.44、70.88、88.60μg/mL的溶液。分別取上述不同濃度溶液1mL加到10mL容量瓶中，然后依次加入1mL去離子水，0.5mL 2mol/L Folin－酚試劑溶液，1.5mL 26.7%Na2CO3溶液，用水定容至10mL。室溫下反應2h，在760nm下測定吸光度。由吸光度對濃度進行線性回歸，得方程:C= 88.438A－2.926，相關系數R2=0.9993。樣品中多酚含量按下式計算:

式中:P－多酚含量(%);C－由回歸方程中計算出的多酚的濃度(μg/mL);V－多酚提取液的總體積(mL);n－稀釋倍數;W－沙棗樣品質量(g)。

1.2.2 沙棗多酚的提取 稱取干燥沙棗粉末50g，以1∶10的料液比加入50%的丙酮浸泡24h后過濾，濾液減壓濃縮除去丙酮得到沙棗多酚提取物。

1.2.3 沙棗多酚清除自由基實驗

1.2.3.1 清除羥基自由基的能力［4］根據Fenton反應原理產生·OH，羥自由基可以將鄰二氮菲－Fe2+氧化為鄰二氮菲－Fe3+，使鄰二氮菲－Fe2+在536nm處的最大吸收峰消失。根據536nm處吸光度的變化情況判斷受試物清除·OH的能力。

精確量取5.0mL PBS磷酸鹽緩沖溶液(pH= 7.4，下同)置于25mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，混勻作空白;精確量取5.0mL PBS、1.0mL鄰二氮菲(7.5mmol/L，下同)、1.0mL FeSO4(7.5mmol/L，下同)于25mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，混勻作為未損傷管;精確量取5.0mL PBS、1.0mL鄰二氮菲、1.0mL FeSO4、1.0mL H2O2(0.1%)置于25mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，混勻作為損傷管。精確量取5.0mL PBS，1.0mL沙棗多酚提取液置于25mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，混勻作為樣品參比管。精確量取5.0mL PBS、1.0mL鄰二氮菲、1.0mL FeSO4、1.0mL沙棗多酚提取液和1.0mL H2O2置于25mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，混勻作為樣品管。將上述容量瓶均置于黑暗處，放置1h，在536nm處測吸光度(A)值，每處理重復3次，用其平均值按下式計算羥自由基清除率:

羥自由基清除率(%)=(A樣品－A損傷)/(A未損－A損傷)×100%

1.2.3.2 清除超氧陰離子自由基的能力［5］鄰苯三酚在堿性條件下迅速自氧化，自氧化過程中產生··可加快鄰苯三酚自氧化速率，同時生成有色中間產物，中間產物的積累在滯后30～45s時，與時間呈良好的線性關系，一般維持4min左右，隨后減慢。有色產物在325nm有強烈的光吸收。

精確量取Tris－HCl緩沖溶液(50mmol/L，pH= 8.2)4.5mL和0.1mL沙棗多酚提取液置于試管中，混勻后在室溫下放置4min，然后于325nm處測定樣品吸光度B值。精確量取Tris－HCl緩沖溶液4.5mL和3mL鄰苯三酚(7mmol/L)，立即開始計時，于325nm處每隔30s測其吸光度A0值，共記錄3min。依上法，精確量取Tris－HCl緩沖溶液4.5mL和0.1mL沙棗多酚提取液，混勻后在室溫下放置4min，立即加入3mL鄰苯三酚并開始計時，于325nm處每隔30s測樣品與鄰苯三酚反應后的吸光度A值，共記錄3min;此實驗重復三次，求其平均值?？瞻坠苡?0mmol/L HCl代替3mL鄰苯三酚。用每組平均值按下式計算超氧陰離子自由基清除率:

式中:A0－未加樣的鄰苯三酚的吸光度;A－樣品與鄰苯三酚反應后的吸光度;B－樣品的吸光度。

1.2.3.3 清除DPPH自由基的能力［6］DPPH自由基是一種穩定的有機自由基，由于DPPH自由基有一個單電子并在517nm處有強的吸收，其乙醇溶液呈深紫色，如果有其他物質提供一個電子使此單電子配對，其吸收將會消失，褪色程度與其接受的電子呈定量關系。

取2mL沙棗多酚提取液及2×10－4mol/L DPPH溶液2mL加入同一具塞試管中，搖勻。30min后測定其在517nm處的吸光度 Ai，同時測定2mL 2× 10－4mol/L DPPH溶液與2mL無水乙醇混合液的吸光度Ac，以及2mL沙棗多酚提取液與2mL無水乙醇混合液的吸光度Aj。根據下列公式計算沙棗多酚對DPPH自由基的清除率:

式中:Ac－未加抗氧化劑時DPPH溶液的吸光度;Ai－加抗氧化劑后DPPH溶液的吸光度;Aj－抗氧化劑在測定波長的吸光度。

1.2.3.4 TBA法測定多酚抗氧化能力［7］硫代巴比妥酸(TBA)法是目前測定脂質過氧化最傳統也是應用最多的方法。脂質中的高不飽和脂肪酸被氧化為過氧化脂質，后期生成大量的丙二醛(MDA)，其可與TBA縮合，在pH 3.0條件下顯粉紅色，此粉紅色物質在532nm處有特征吸收，可根據吸光度值A判斷脂質過氧化的程度。

分別加入相同濃度不同材料的多酚提取液、VC(mg/mL)和蒸餾水4mL置于具塞錐形瓶中，依次加4.1mL2.5%亞油酸溶液，8mL 0.05mol/L PBS(pH7.4)緩沖溶液，3.9mL去離子水，以無水乙醇作為基礎對照?；靹蚝笾糜?0℃培養箱中避光培養。每隔24h取樣1mL，加入20%三氯乙酸1mL，靜置20min加入2mL 0.3%硫代巴比妥酸溶液，混勻后沸水浴加熱20min，室溫下冷卻后加入4mL正丁醇，充分搖勻，于3000r/min離心15min，取上清液于532nm測定樣品吸光度A。

2 結果與分析

2.1 尖果沙棗與大果沙棗不同果、葉中多酚物質對三種自由基的清除作用

由表1可以看出，尖果沙棗和大果沙棗的青果、熟果多酚提取物對羥自由基、超氧陰離子自由基以及DPPH自由基均具有一定的清除作用，且清除率均高于50%。其中尖果沙棗青果、熟果多酚提取物對三種自由基的清除能力高于大果沙棗青果和熟果，而尖果沙棗青果多酚提取物對三種自由基的清除能力又大于熟果。因此，尖果沙棗青果多酚提取物對三種自由基具有較好的清除效果。

表1 不同沙棗果中多酚物質對三種自由基的清除率(%)

從表2可知，尖果沙棗和大果沙棗的嫩葉、老葉多酚提取物對三種自由基具有不同程度的清除作用。尖果沙棗嫩葉、老葉多酚提取物對羥自由基以及超氧陰離子自由基的清除能力高于大果沙棗嫩葉和老葉，尖果沙棗以及大果沙棗嫩葉、老葉多酚提取物對DPPH·的清除能力差異不明顯。

表2 不同沙棗葉中多酚物質對三種自由基的清除率(%)

2.2 尖果沙棗與大果沙棗不同果、葉中多酚物質對脂質過氧化的抑制作用

由圖1可知，四種材料的多酚提取物均可有效地防止脂質過氧化作用。在第10d，亞油酸氧化達到最大值，同一時段尖果沙棗青果多酚提取物比尖果沙棗熟果以及大果沙棗青果、熟果所測得的吸光度A值都小，表明其對脂質過氧化的阻斷作用最強，且其效果明顯優于同濃度的VC。隨后由于生成的丙二醛量減少，A值下降。

圖1 不同沙棗果中多酚物質對亞油酸的抗氧化作用

尖果沙棗以及大果沙棗葉中多酚提取物對脂質過氧化的阻斷趨勢與果實的趨勢相似。實驗結果見圖2，從圖2中可看出尖果沙棗嫩葉多酚提取物與其老葉以及大果沙棗嫩葉、老葉相比，能更有效地防止脂質過氧化作用。

圖2 不同沙棗葉中多酚物質對亞油酸的抗氧化作用

3 結論

本實驗研究了尖果沙棗和大果沙棗的青果、熟果、嫩葉、老葉中多酚提取物對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除能力以及對脂質過氧化作用的抑制作用。研究表明，尖果沙棗青果以及嫩葉多酚提取物相對于其余6種實驗材料具有較好的抗氧化活性，而且尖果沙棗在新疆分布較廣、資源豐富、價廉易得，因此，將其研究開發為抗氧化產品，具有很好的應用前景。

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Study on comparing the antioxidant capacity of angustifolia polyphenol in different fruits and leaves

LIU Dan－dan1，LI Bing－qi1，CHEN Han－ying2，TONG De－jun3，LIU Hong1，*
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Shihezi University，Shihezi 832003，China; 2.College of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi 832003，China; 3.Normal College，Shihezi University，Shihezi 832003，China)

The polyphenol in fruits and leaves from Elaeagnus oxcarpa and Elaeagnus moorcroftii was extracted by using acetone，and the antioxidant activities were studied.The scavenging capacities of polyphenol in different materials on hydroxyl free radical，superoxide anion radical and 2，2－diphenyl－1－picrylhydrazyl were assayed. Meanwhile，the inhibition effect of lipid peroxidation was studied with thiobarbituric acid(TBA)method.The results showed that the polyphenol in green fruit and tender leaf of Elaeagnus oxcarpa had better scavenging capacity on ·OH，O2－·and DPPH·during 8 kinds of material，moreover，the scavenging ratio was above 50%，respectively. And the inhibition effect of lipid peroxidation was higher than other material obviously.Elaeagnus oxcarpa had better antioxidant activities than Elaeagnus moorcroftii in vitro.

angustifolia;polyphenol;free radicals;antioxidant activity;thiobarbituric acid method

TS255.1

A

1002－0306(2011)12－0093－03

沙棗主要分布在我國的西北各省區和內蒙古西部，沙棗果、葉中的多酚類物質含量十分豐富［1］。多酚類物質是從天然植物中發現的一類重要的抗氧化活性成分，具有抗氧化、抗齲齒、抗菌、抑制膽固醇上升、消除活性氧、抑制癌癥發生等作用［2－3］。新疆沙棗的分布面積廣、產量高、價格便宜，本實驗從測定活性氧清除率、DPPH自由基清除率以及對脂自由基的抑制作用方面進行研究，探討沙棗多酚的抗氧化活性，對充分利用本地資源，開發出更多更好的天然抗氧化劑，具有重要的現實意義。

2010－11－19 *通訊聯系人

劉丹丹(1986－)，男，在讀碩士研究生，研究方向:天然產物的研究與開發。

教育部“春暉計劃”項目(Z2006－1－83003)。