少孢根霉發酵豆粕制備大豆異黃酮苷元

孫 強，孫潔心，張永忠

(1.黑龍江農墾職業學院，黑龍江哈爾濱150025; 2.東北農業大學應用化學系，黑龍江哈爾濱150030; 3.教育部大豆生物學重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

少孢根霉發酵豆粕制備大豆異黃酮苷元

孫 強1，孫潔心1，張永忠2，3，*

(1.黑龍江農墾職業學院，黑龍江哈爾濱150025; 2.東北農業大學應用化學系，黑龍江哈爾濱150030; 3.教育部大豆生物學重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

研究了以少孢根霉作為菌種對豆粕進行發酵生產大豆異黃酮苷元的方法，通過單因素實驗和正交實驗確定了發酵的最佳培養基是豆粕∶水=1∶3，0.8%乳酸，最佳發酵條件是發酵時間24h，發酵溫度30℃。在此條件下，黃豆苷元轉化率為90.95%，染料木黃酮轉化率為92.24%。為豆粕的綜合利用和大豆異黃酮苷元的產業化生產提供參考。

少孢根霉，固態發酵法，大豆異黃酮苷元，高效液相色譜

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆豆粕 哈高科大豆食品有限責任公司;少孢根霉(CCTCC AF 96004) 由東北農業大學生命學院微生物實驗室提供;斜面菌種保藏培養基和菌種擴培培養基 均為PDA培養基;染料木黃酮、黃豆苷元、染料木苷和黃豆苷標準品 sigma公司;甲醇色譜純;冰醋酸等 國產分析純試劑。

高效液相色譜儀 含P682HPLC泵、UVD170U紫外檢測器、ASI-100自動進樣器、色譜柱Nova-Pak C18柱(3.9×150mm 4μm)，美國戴安公司;電子天平上海天平儀器廠;H.H.S 21-2R型電熱恒溫水浴鍋上海醫療器械五廠;DH600A型電熱恒溫培養箱天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜法檢測大豆異黃酮含量 測定條件：流動相為甲醇∶0.5%乙酸=40∶60(v/v)，柱溫：50℃，流速：1.0mL/min，檢測波長：254nm，進樣量：10μL。

標準曲線的繪制：分別精密稱取標準品染料木苷(genistin)和黃豆苷(daidzin)各1mg、染料木黃酮(genistein)和黃豆苷元(daidzein)各5mg，用甲醇分別定容到10mL容量瓶中，制成標準儲備液。然后分別從各標準儲備液中吸取一定量，用甲醇稀釋到1、2、3、4、5μg/mL待測。以峰面積(y)為縱坐標，大豆異黃酮濃度(x)為橫坐標，對各組分濃度與峰面積關系進行回歸分析，分別繪制標準曲線。

1.2.2 空白實驗 準確稱量豆粕，加入4倍水，在0.08MPa滅菌20min。用80%乙醇常溫下在磁力攪拌條件下提取30min，料液比 1∶4，提取2次，在4000r/min離心并合并提取液，定容至50mL，稀釋后過濾，用高效液相色譜法檢測得到發酵前豆粕中大豆異黃酮糖苷和苷元含量，三組平行數據取平均值。

1.2.3 發酵提取路線 準確稱量豆粕，加入碳源、無機鹽等，加入4倍水，在0.08MPa滅菌20min，加入0.8%乳酸，拌勻。加入孢子菌懸液，在恒溫箱中30℃恒溫培養24h。用80%乙醇常溫下在磁力攪拌條件下提取30min，料液比1∶4，提取2次，在4000r/min離心并合并提取液，定容至50mL，稀釋后過濾，用高效液相色譜法檢測，計算異黃酮苷元的轉化率

轉化率(%)=發酵前后異黃酮苷元質量之差/發酵前大豆異黃酮糖苷質量×100%

1.2.4 孢子菌懸液的制備 接種少孢根霉于固體平板培養基上，在恒溫箱中30℃恒溫培養72h，用無菌生理鹽水洗下孢子，稀釋至106cfu/mL，放置于冰箱中4℃備用。

1.2.5 最佳發酵培養基的確定

1.2.5.1 碳源的選擇 分別加入10%葡萄糖、蔗糖和淀粉，按照1.2.3發酵提取，根據異黃酮苷元的轉化率選擇最佳碳源。

1.2.5.2 碳源添加量的確定 分別添加5%、10%、15%最佳碳源，按照1.2.3發酵提取，根據異黃酮苷元的轉化率選擇碳源添加量。

1.2.5.3 無機鹽及其添加量的確定 通過四因素三水平正交實驗確定添加無機鹽及其最佳添加量，因素水平如表1所示。

表1 無機鹽正交實驗因素表

1.2.5.4 水分比例的選擇 分別使發酵培養基中干料與水分比例為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，按照1.2.3發酵提取，根據異黃酮苷元的轉化率選擇最佳水分比例。

1.2.6 最佳發酵條件的確定

1.2.6.1 發酵時間的選擇 選用最佳發酵培養基，在恒溫箱中30℃分別恒溫培養18、24、30、36h，用1.2.3中條件提取檢測，根據異黃酮苷元轉化率確定最佳發酵時間。

1.2.6.2 發酵溫度的選擇 選用最佳發酵培養基，分別在28、30、37、40℃恒溫培養，用1.2.3中條件提取檢測，根據異黃酮苷元轉化率確定最佳發酵溫度。

2 結果與討論

2.1 高效液相色譜法測定大豆異黃酮標準曲線

表2 標準曲線(y-峰面積x-化合物濃度)

2.2 空白實驗結果

用HPLC法檢測發酵前豆粕中大豆異黃酮糖苷和苷元含量，三組平行數據取平均值。結果如表3所示。

表3 豆粕中異黃酮的含量(μg/g)

由表3可知，豆粕中大豆異黃酮主要以糖苷形式為主，苷元形式的異黃酮約占異黃酮總量的4%左右。

2.3 最佳發酵培養基的確定

2.3.1 最佳碳源的測定 分別加入10%葡萄糖、蔗糖和淀粉，發酵提取后，HPLC法檢測黃豆苷元和染料木黃酮結果如圖1所示。

圖1 不同碳源對異黃酮苷元轉化率影響的比較

由圖1可以看出，在不加入其他碳源的情況下最高。在加入葡萄糖的條件下，少孢根霉直接利用葡萄糖作為碳源，而降低了對異黃酮糖苷中糖苷基的利用率，所以對異黃酮苷元的轉化率沒有積極的影響。因此選擇的條件為不加入其他碳源，此時黃豆苷元的轉化率是72.92%，染料木黃酮的轉化率為74.64%。

2.3.2 無機鹽及其添加量的確定 通過4因素3水平正交實驗，HPLC法檢測結果如表4所示。

表4 無機鹽正交實驗結果分析表

由表4可以看出，不加入無機鹽的情況下異黃酮苷元的轉化率最高。通過極差分析可以看出，四因素對于異黃酮苷元轉化率的影響程度依次為B＞C＞D＞A。加入無機鹽對異黃酮苷元的轉化率沒有積極影響，因此選用條件為不加入無機鹽。

2.3.3 水分比例的確定 分別使發酵培養基中干料與水分比例為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，HPLC法檢測黃豆苷元和染料木黃酮結果如圖2所示。

圖2 不同水分比例的比較

由圖2可以看出，培養基中干料與水分比例為1∶3時異黃酮苷元轉化率最高。水分比例為1∶2時，不利于微生物生長繁殖;少孢根霉是需氧菌，水分過多不利于菌在培養基內部的生長。因此，當水分比例為1∶3時為最佳培養基條件。

2.4 最佳發酵條件的確定

2.4.1 發酵時間的選擇 選用最佳發酵培養基，在恒溫箱中30℃分別恒溫培養18、24、30、36h，HPLC法檢測黃豆苷元和染料木黃酮結果如圖3所示。

由圖3可知，在發酵24h后，黃豆苷元和染料木黃酮的轉化率變化很小。因此選擇發酵時間為24h。

2.4.2 發酵溫度的選擇 選用最佳發酵培養基，分別在28、30、37、40℃恒溫培養，HPLC法檢測黃豆苷元和染料木黃酮結果見圖4。

圖3 不同發酵時間的比較

圖4 不同發酵溫度的比較

由圖4可知，在30℃發酵，黃豆苷元和染料木黃酮的轉化率最高，在37℃和40℃轉化率均降低。因此選擇30℃為最佳發酵溫度。

發酵后，豆粕中異黃酮的含量如表5所示。

表5 發酵后豆粕中異黃酮的含量(μg/g)

由表5可以看出，發酵后苷元形式的大豆異黃酮含量大幅度升高。說明發酵過程使糖苷形式異黃酮轉化為苷元形式的異黃酮，此條件下黃豆苷元轉化率為92.24%，染料木黃酮轉化率為92.24%。

3 結論

本實驗通過單因素實驗和正交實驗優選出少孢根霉發酵豆粕的最佳發酵培養基和最佳發酵條件，確定少孢根霉發酵豆粕制備大豆異黃酮苷元的最佳發酵培養基是豆粕∶水=1∶3，0.8%乳酸。最佳發酵條件是發酵時間24h，發酵溫度30℃。此條件下黃豆苷元轉化率為90.95%，染料木黃酮轉化率為92.24%。微生物發酵豆粕制備大豆異黃酮苷元及其提取分離的研究，對綜合利用豆粕資源、提高其附加值具有重要的意義，也為豆粕的綜合利用開辟一條新途徑。

［1］張永忠，孫艷梅.大豆異黃酮研究中的名詞術語［J］.中國糧油學報，2004(4):46.

［2］Wang H J and Murphy P A.Isoflavone composition of American and Japanese soybeans in lowa:effects if variety crop year and location［J］.JournalofAgriculturaland Food Chemistry，1994，42:1674-1677.

［3］Naim M，GestetnerB，ZikahS.Soybean Isoflavones. Characterization，Determination and Antifungal Activity［J］.J Agric Food Chem，1974，22:806-810.

［4］Naim M，Gestetner B，Bondi A.Antioxidative and Antihemolytic Activities of Soybean Isoflavones［J］.J Agric Food Chem，1976，24(6):1174-1177.

［5］LIU J，CHANG S K，WIESENBORN D.Antioxidant properties of soybean isoflavone extract and tofu in vitro and in vivo［J］.J Agric Food Chem，2005，53(6):2333-2340.

［6］MACGREGOR C A，CANNEY P A，PATTERSEN G，et al.A randomized double-blind controlled trial of oral soy supplements in patients with early breast cancer［J］.Eur J Cancer，2005，41 (5):708-714.

［7］RAVINDRANATH M H，MUTHUGOUNDER S，PRESSER N，et al.Anticancer therapeutic potential of soy isoflavone，genistein［J］.Adv Exp Med Biol，2004，546:121-165.

［8］錢麗麗，張永忠，左鋒.提高大豆異黃酮活性作用的研究進展［J］.食品工業科技，2005，26(3):180-182.

［9］KYIOSA WA I，MATSUYAMA J，ARAI C，et al.Suppressive effects of the methanol extracts from soybean products on SOS response of salmonella typhimurium induced by mutagens and their contents of isoflavones［J］.Journal of the Japanese Society for Food Science and Technology，1995，42(10):835-842.

［10］SETCHELL K DR，BROWN N M，ZIMMER-NECHEMIAS L，et al.Evidence for lack of absorption of soy isoflavone glycosides in humans，supporting the crucial role of intestinal metabolism for bioavailability［J］.Am J Clinical Nutrition，2002，76:447-453.

［11］XU X，HARRIS K S，Wang H J，et al.Bioavailability of soybean isoflavones depends upon gut microflora in women［J］.J Nutr，1995，125(9):2307-2315.

［12］孫艷梅，張永忠，等.大豆β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷的研究［J］.中國糧油學報，2006(2):86-89.

［13］張永忠，李木子，等.“Amano”β-糖苷酶水解大豆異黃酮技術的研究［J］.食品科學，2008，29(5):254-258.

［14］井樂剛，張永忠.微生物發酵制備大豆異黃酮的研究進展［J］.微生物學通報，2003，30(2):86-88.

［15］吳定，袁建，等.固態發酵豆粕生產大豆異黃酮研究［J］.中國糧油學報，2004，19(2):72-74.

［16］蔣大海，田娟娟，等.固態發酵法制備大豆異黃酮苷元［J］.食品科學，2008，29(4):163-166.

Study on the solid fermentation in producing of soybean isoflavone glycoside by Rhizopusolig osporus saito

SUN Qiang1，SUN Jie-xin1，ZHANG Yong-zhong2，3，*
(1.Heilongjiang Nongken Vocational College，Harbin 150025，China; 2.Department of Applied Chemistry，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China; 3.Key Laboratory of Soybean Biology，Ministry of Education，Harbin 150030，China)

The experiment was designed to study the method of isoflavone preparation by fermentation on soybean residue.According to the single factors and the orthogonal test，it showed that the optimal substrate was the soybean-water ratio 1∶3 and 0.8%lactic acid，the optimal fermentation conditions was the total time 24h and the temperature 30℃.The transformation ratio of daidzein was 90.95%，and the transformation ratio of genistein was 92.24%under the conditions.It was the reference resources for integrated utilization of soybean residue and production of isoflavone glycoside.

Rhizopusolig osporus saito;solid fermentation;soybean isoflavone glycoside;HPLC

TS201.3

A

1002-0306(2011)12-0258-04

大豆中天然存在的大豆異黃酮總共有12種，可以分為3類，即黃豆苷類(Daidzin Groups)、染料木苷類(GenistinGroups)、大豆黃素苷類 (Glycitin Groups)，以游離型、葡萄糖苷型、乙?；咸烟擒招?、丙二酰基葡萄糖苷型等4種形式存在［1］。大豆異黃酮中97%～99%是以大豆異黃酮糖苷形式存在，苷元形式僅為大豆異黃酮總量的1%～3%［2］。很多調查研究報道以及動物實驗表明，大豆異黃酮具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地預防和抑制白血病、骨質疏松、結腸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、婦女更年期綜合癥等多種疾病，尤其是對乳腺癌和前列腺癌有積極的預防和治療作用［3-7］。一般認為苷元(主要是genistein和daidzein)是大豆異黃酮的主要活性組分。也就是說，大豆異黃酮的苷元形式比糖苷形式活性要高，特別是染料木黃酮(genistein)的活性更高［8-9］。食品中的異黃酮主要以糖苷的形式存在，生物體一般不吸收此種形式［10］。大豆異黃酮糖苷在人的消化酶(特別是β-葡萄糖苷酶)作用下水解成其苷元形式，才開始被吸收［11］。目前大豆異黃酮糖苷水解的常用方法有：酸水解法、堿水解法和酶水解法等［12-13］。利用微生物發酵的方法生產大豆異黃酮，和化學合成、提取法相比，不但可以使產量大大增加，而且還可以降低成本，更具有吸引力的是能直接生產苷元［14］。發酵法制備大豆異黃酮苷元具有成本低、適合工業化生產的優點［15］。而且發酵不影響異黃酮的含量，但改變了異黃酮種類的分布。這是因為在發酵過程中，真菌產生的大量β-葡萄糖苷酶使異黃酮葡萄糖苷大量水解，從而導致游離型的異黃酮顯著增加［16］。本研究旨在確定少孢根霉發酵豆粕制備大豆異黃酮苷元的最佳條件，以求為發酵法制備大豆異黃酮苷元的工業化，為生產低成本、富含大豆異黃酮苷元的產品開辟途徑。

2010-09-17 *通訊聯系人

孫強(1979-)，男，講師，碩士，研究方向:糧食油脂與植物蛋白工程。

國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2008AA10Z331)。