酶輔助提取紫甘藍中原花青素的工藝優化

李松林，湯 彤

(淮陰工學院食品工程系，江蘇淮安223003)

酶輔助提取紫甘藍中原花青素的工藝優化

李松林，湯 彤

(淮陰工學院食品工程系，江蘇淮安223003)

以紫甘藍為原料，在單因素實驗基礎上，通過中心組合設計和響應面分析法，對酶輔助提取紫甘藍中原花青素的條件進行研究。確定酶輔助提取的最佳工藝條件是:酶解時間2.5h，酶解溫度43.39℃，纖維素酶濃度0.02%，果膠酶濃度0.02%，在此工藝條件下，原花青素的提取率為17.3%。

紫甘藍，原花青素，酶提取，中心組合設計，響應曲面

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫甘藍 購自本地菜市場;葡萄籽原花青素標準品 天津市尖峰天然產物研究開發有限公司;香草醛 天津市光復精細化工研究所;乙醇、甲醇、鹽酸 均為分析純，購于蚌埠化學試劑廠;纖維素酶、果膠酶 張家港市金源生物化工有限公司。

722N可見光分光光度計、FA2004N電子天平上海民橋精密儀器科學有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司;旋轉蒸發儀(RE-52) 上海雅榮生化儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原花青素的檢測方法 采用香草醛-鹽酸法［19］。原花青素提取率的計算公式如下:

1.2.2 紫甘藍原花青素的酶輔助提取 利用粉碎機對紫甘藍進行粉碎，加入500mL蒸餾水，加入酶進行水解，過濾后得到的濾液使用旋轉蒸發儀蒸干大部分水分，余下的濾液配成500mL 60%的乙醇溶液在60℃條件下浸提，再在50℃條件下用旋轉蒸發儀將乙醇蒸出，所剩體積約為原體積的五分之一，過濾后定容，即得提取液。將提取液稀釋一定的倍數，測定原花青素的含量。

1.2.3 單因素實驗設計 精確稱取一定質量紫甘藍放入錐形瓶中，采用復合酶輔助法提取原花青素，考察酶解時間、酶解溫度、纖維素酶的添加量和果膠酶的添加量對原花青素提取率的影響。

1.2.4 紫甘藍原花青素的酶輔助提取的工藝優化在單因素實驗結果的基礎上，采用中心組合設計和響應面分析法對酶輔助提取的工藝進行優化。實驗因素及水平選取見表1。

表1 酶輔助提取紫甘藍原花青素實驗的因素與水平

2 結果與分析

2.1 影響酶輔助提取原花青素的單因素實驗

2.1.1 酶濃度對原花青素提取率的影響 由圖1和圖2可知，隨著酶濃度的增加，原花青素的提取率隨之相應增加。但當纖維素酶和果膠酶的濃度分別大于0.016%和0.022%時，原花青素的提取率開始下降。這可能是由于與纖維素酶和果膠酶充分接觸的纖維素和果膠質被完全分解，或者由于木質素等物質阻礙了酶與底物的接觸所導致的。

圖1 纖維素酶濃度對原花青素提取率的影響

2.1.2 酶解時間和酶解溫度對原花青素提取率的影響 圖3表明，原花青素的提取率隨著酶作用時間的延長而增大(纖維素酶添加量為0.016%，果膠酶添加量為0.022%)，在作用的前2h提取率增加較快。當酶解時間超過2h后，提取率開始下降。綜合考慮，復合酶作用時間以2h為合適。由圖4可以看出，隨著酶解溫度的增高(纖維素酶添加量為0.016%，果膠酶添加量為0.022%)，原花青素的提取率逐漸增加，在40℃時到達最高值。但隨著溫度的繼續增加，原花青素的提取率開始下降。這是因為在復合酶的作用下，催化反應的速度隨著溫度的升高而加快，但酶是蛋白質，可隨著溫度的升高而變性，且多數變性都不可逆。所以在較高溫度下，隨著時間的延長，酶逐漸變性，導致提取率降低。故提取溫度選擇40℃左右較為合適。

圖2 果膠酶濃度對原花青素提取率的影響

圖3 酶解時間對原花青素提取率的影響

圖4 酶解溫度對原花青素提取率的影響

2.2 中心組合設計及響應面法優化紫甘藍原花青素的酶法輔助提取

采用回歸正交組合設計，結合單因素實驗結果，考察纖維素酶的添加量(X1)，酶解溫度(X2)，酶解時間(X3)和果膠酶的添加量(X4)對提取率(Y)的影響。酶輔助提取原花青素的實驗方案與結果如表2所示。利用Design-expert軟件對表2數據進行回歸擬合，得到紫甘藍原花青素提取率Y與自變量X1、X2、X3和X4的二次回歸方程為:

對該模型進行的方差分析及顯著性檢驗結果見表3。

在置信水平為95%的條件下，當參數的p-value＜0.05時，認為此因素或者因素之間的交互作用對于模型的影響是顯著的。由表3可知，酶解時間X3、酶解溫度X2、纖維素酶的添加量X1、果膠酶的添加量X4及其二次項，以及各因素之間的交互作用(X1X2，X1X3，X2X3，X3X4)對提取率的影響均在顯著水平以上。因變量與自變量之間的多元回歸關系是高度顯著的(復相關系數R2=0.9935)，該模型對Y值變化的描述程度為99.35%，且失擬性檢驗結果為不顯著，表明實驗設計結果可靠。圖5為原花青素提取率的實驗數值與二次回歸模型預測值之間的比較。從圖5中可以看出模型充分覆蓋了所研究的實驗范圍。刪除不顯著的回歸數據項后，重新擬合的最優回歸模型為:

表2 酶法輔助提取紫甘藍原花青素的正交設計實驗方案與結果

表3 響應面實驗方差分析

圖5 原花青素提取率的實驗數值與二次回歸模型預測值之間的比較

圖6～圖9中的響應面圖較好地描述了纖維素酶的添加量(X1)，酶解溫度(X2)，酶解時間(X3)，果膠酶的添加量(X4)對原花青素提取率的影響過程。

圖6 Y=(X1，X2)的響應曲面圖

圖7 Y=(X1，X3)的響應曲面圖

圖8 Y=(X2，X3)的響應曲面圖

從圖6中可以看出，當X1保持一定時，提取率隨著X2的升高呈先增后減趨勢。當X2一定時，提取率隨著X1的增大呈先增后減趨勢。圖7表示，當X3保持不變時，隨著X1的增加，提取率先增大后減小。在圖8中，當X3保持一定時，提取率隨著X2的增大呈先增后減的趨勢。當X2一定時，X3的增加會使提取率不斷增大，隨后保持穩定。由圖9可以看出，當X3一定時，提取率隨著X4的增大呈先增后減趨勢。當X4一定時，X3的增加會使提取率不斷增大，隨后保持穩定。

圖9 Y=(X3，X4)的響應曲面圖

由此可知，原花青素提取率與上述四個因素均存在對應關系。由Design-expert軟件分析得出各因素最優水平組合為:X1=0.02，X2=43.39，X3=2.50，X4=0.02，Y=17.6366，即提取率為17.64%。在實際實驗中，近似值取X1=0.02，X2=43，X3=2.50，X4= 0.02。在該條件下，實驗得原花青素平均提取率為17.3%，誤差為1.93%。這說明采用四因素二次回歸正交組合設計尋求的最佳工藝條件是可行的。

3 結論

采用中心組合設計和響應面分析法，得到酶輔助法提取紫甘藍原花青素的最佳工藝條件:酶解時間為2.5h，酶解溫度為43.39℃，纖維素酶的添加量為0.02%，果膠酶的添加量為0.02%，此時原花青素提取率為17.3%。用傳統溶劑法提取紫甘藍原花青素時，原花青素提取率僅為10%左右。與其相比，酶輔助提取法是較為有效的方法。但總體來看，提取率仍然較低，這可能是由于紫甘藍中的原花青素與蛋白質和纖維素呈結合狀態，而游離原花青素相對較少。此外紫甘藍原花青素含量還與紫甘藍的貯存條件有關，貯存溫度的變化或放置時間的長短都會影響原花青素的提取效果，這些都需要進一步的研究。

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Optimization of enzyme-assisted extracting technology of proanthocyanidins from purple cabbage

LI Song-lin，TANG Tong
(School of Food Engineering，Huaiyin Institute of Technology，Huai’an 223003，China)

To optimize proanthocyanidins yield from purple cabbage extracted by enzymatic-assisted technology，single factor experiments followed by central composite design combined with response surface analysis were carried out.Results showed that the optimal enzymatic-assisted extraction，namely using 0.02%cellulase and 0.02%pectinase to extract the powdered material at temperature of 43.39℃ for 2.5 hour，resulted in a proanthocyanidins yield of up to 17.3%.

purple cabbage;proanthocyanidins;enzymatic extraction;central composite design;response surface methodology

TS255.1

B

1002-0306(2011)09-0315-04

紫甘藍(Brassica oleracea L.var.Capitata DC.)屬十字花科蕓蔓屬，二年生植物，又稱紫椰菜、紫苞菜，是結球甘藍中的一個類型，易種、易采，產量大，通體呈紫紅色。紫甘藍含有豐富的維生素C、較多的維生素B族和維生素E族以及豐富的硫元素。原花青素(Procyanidins)是一類多酚化合物的總稱，由不同數量的兒茶素或表兒茶素縮合而成，其基本組成單位是黃烷-3-醇和黃烷-3，4-二醇［1］，廣泛存在于植物類食品中。各國學者對不同來源的植物原花青素進行了深入的研究［2-3］，發現甘藍中的原花青素具有預防心臟疾病［4］、食品抗氧化［5］、預防心血管疾病［6］等功能，同樣也發現葡萄籽中的原花青素具有抗氧化［7］、抗衰老［8］、抗腫瘤［9］等多種生物活性和藥理作用［10-15］。因此人們對原花青素的研究越來越重視，尋找新的富含原花青素的資源和適合于工業化提取、檢測原花青素的方法是兩個研究的熱點。原花青素的提取主要采用有機溶劑提取法［16-17］，但由于原花青素與紫甘藍的纖維組織結合較緊密，不容易溶出，導致提取率較低。植物細胞壁主要成分是纖維素、半纖維素和果膠質。使用纖維素酶和果膠酶作用于紫甘藍，可以使細胞壁及細胞間質中的纖維素、半纖維素、果膠等物質降解，引起細胞壁及細胞間質結構產生局部疏松、膨脹、崩潰等變化，從而增大有效成分的擴散面積，促進有效成分提取率提高［18］。因此，本實驗采用纖維素酶和果膠酶對紫甘藍原花青素進行酶輔助提取及工藝優化，為紫甘藍的進一步開發和綜合利用提供科學依據。

2010-10-08

李松林(1982-)，男，博士，講師，研究方向:食品資源的開發與利用。