阿魏側耳多糖酶水解制備工藝研究△

王瑩，李國玉，黃健，魏秀巖，馬躍平，高建波，王金輝,,3*

(1.石河子大學藥學院，新疆 石河子 832002；2.沈陽藥科大學中藥學院，遼寧 沈陽 110016；3.教育部省部共建新疆特種植物藥資源重點實驗室，新疆 石河子 832002)

國家863項目(2008AA10Z323)

*王金輝,E-mail：tcm_shz@yahoo.cn

阿魏側耳多糖酶水解制備工藝研究△

王瑩1，李國玉1，黃健2，魏秀巖2，馬躍平2，高建波1，王金輝1,2,3*

(1.石河子大學藥學院，新疆 石河子832002；2.沈陽藥科大學中藥學院，遼寧 沈陽110016；3.教育部省部共建新疆特種植物藥資源重點實驗室，新疆 石河子832002)

目的采用蛋白酶水解法提取制備阿魏側耳多糖。方法采用硫酸-苯酚顯色測定多糖的含量，采用UV法測定蛋白質的含量。研究不同蛋白酶在不同條件下對阿魏側耳多糖提取率和除蛋白效果的影響。結果最佳酶底比為8mg·g-1，溫度60℃，最適pH值為6.0，最佳酶解時間為90min。結論采用蛋白酶水解法可以制得純度很高的阿魏側耳多糖。

蛋白酶水解法；阿魏側耳多糖；提取制備工藝

阿魏側耳PleurotusferulaeLanzi又名阿魏菇，是一種新疆特色的食、藥兩用大型真菌，因寄生或腐生在藥用植物阿魏上而得名[1]。試驗研究表明阿魏側耳多糖(Pleurotusferulaepolysaccharide, PFP)對γ輻射產生的自由基所造成的鼠肝線粒體細胞膜傷害具有抗氧化抑制效果[2]。巨噬細胞吞噬作用試驗、遲發型變態反應試驗、白細胞介素-2(IL-2)的誘生與檢測試驗測得阿魏側耳粗多糖具有免疫增強活性[3]。同時，還發現阿魏菇多糖具有明顯的抗氧化[4]、延緩衰老[5]、抗腫瘤[6-11]、抑制核糖核酸酶[12]等作用。

阿魏側耳多糖的提取方法研究，多簡單采用熱水浸提的方法[3,12-14]。筆者研究表明，阿魏側耳多糖提取過程中，蛋白質類成分干擾很大，采用常規的離子交換色譜法、溶劑法(Sevage法)除蛋白的過程復雜，并且容易引進有機溶劑等雜質，嚴重影響阿魏側耳多糖的質量。因此，本研究采用蛋白酶水解的方法，建立了阿魏側耳多糖的高效的提取純化方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器

SartoriusBP211D型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)，SK5200HP型超聲波清洗機(上海科導超聲有限公司)，UV-2409型紫外分光光度計，DZKW型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器廠)，791型磁力加熱攪拌器(南匯電訊器材廠)，EYBLA旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)，SHZ-D9(Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)，DzF型真空干燥箱(上海市精密實驗設備有限公司)。

1.2試藥

阿魏側耳購于新疆石河子市，經石河子大學譚勇博士鑒定為阿魏側耳PleurotusferulaeLanzi。標本號為No.20071002001，保存在石河子大學藥學院。葡萄糖、苯酚、無水乙醇、濃硫酸等均為分析純，水為二重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1利用文獻硫酸-苯酚法[12]測定多糖的含量

2.1.1 苯酚溶液制備 苯酚5g，用少量水溶解，轉移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成苯酚溶液。

2.1.2 標準曲線的繪制 稱取烘干至恒重的無水葡萄糖0.101 1g，溶于100mL蒸餾水中，配成1.011mg·mL-1的標準溶液。然后分別取標準溶液0.2,0.3,0.4,0.6,0.8mL置5只試管中，加蒸餾水至1.0mL，加入硫酸-苯酚顯色液(加1mL苯酚溶液和5mL硫酸)，沸水浴30min，放至室溫，在490nm處，測其吸光度A。用同樣處理的蒸餾水做空白對照，以吸光度A為縱坐標，糖濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=1.429 3X-0.044 5，r=0.999 8，表明多糖在0.028 89～0.115 5 mg·mL-1具有良好的線性關系。

2.1.3 測定法 樣品加1 mL苯酚溶液和5 mL硫酸，沸水浴30 min，冷卻至室溫，490 nm處測吸光度A，利用標準曲線法，計算，即得。

2.2多糖提取條件正交試驗優化

2.2.1因素水平設計 選取影響多糖提取的3個主要因素：溫度(A)、時間(B)、料液比(C)，采用L9(34)進行了正交試驗，以多糖得率為指標，優選最佳工藝。為了提高統計分析的可靠性，每一條件下都作了重復試驗(n=3)，測定結果取其平均值。因素水平表見表1。

表1 阿魏側耳多糖提取正交試驗因素水平表

2.2.2 正交試驗結果及分析 試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 阿魏側耳多糖提取正交試驗設計及結果

表3 方差分析表

表2直觀分析可知,RC>RA>RB，即影響阿魏菇多糖提取率的諸因素的主次關系依次是料液比(C)>浸提溫度(A)>浸提時間(B)。

表3方差分析表明，最佳工藝條件為A1B1C3。即浸提溫度70 ℃，浸提時間2 h，料液比1∶40。

2.3阿魏側耳多糖木瓜蛋白酶解純化工藝的考察

2.3.1最適酶用量的確定 取7個具塞錐形瓶，每瓶加入阿魏側耳提取液20mL(0.5568g·mL-1)，分別加入木瓜蛋白酶(酶與底物質量比)0,2,4,6,8,10,12mg·g-1，用HCL調pH6，50℃水浴2h后沸水浴10min使酶滅活，冷卻至室溫，3000r·min-1離心5min，取上清液加95%乙醇至醇濃度80%，3000r·min-1離心10min取沉淀，同法洗滌沉淀3次，測多糖得率，結果見表4，確定最佳酶底比為8mg·g-1。

表4 最適酶用量考察結果

2.3.2 最適酶解時間的確定 取7個具塞錐形瓶，每瓶加入阿魏側耳提取液20 mL(0.556 8 g·mL-1)，分別加入木瓜蛋白酶89.12 mg用HCL調pH 6，分別50℃水浴0,30,60，90，120，150，180 min后沸水浴10 min使酶滅活，冷卻至室溫，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液加95 %乙醇至醇濃度80 %，3 000 r·min-1離心10 min取沉淀，同法洗滌沉淀3次，測多糖得率,結果見表5，確定最佳酶解時間為90 min。

表5 最適酶解時間考察結果

2.3.3 最適pH值的確定 取3個具塞錐形瓶，每瓶加入阿魏側耳提取液20 mL(0.556 8 g·mL-1)，分別加入木瓜蛋白酶89.12 mg用HCL分別調pH為3、4、5、6、7、8、9，分別50 ℃水浴90 min后沸水浴10 min使酶滅活，冷卻至室溫，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液加95 %乙醇至醇濃度80 %，3 000 r·min-1離心10 min取沉淀，同法洗滌沉淀3次，測多糖得率，結果見表6，確定最佳酶解pH值為6。

表6 最適酶解時間考察結果

2.3.4 最適酶解溫度的確定 取7個具塞錐形瓶，每瓶加入阿魏側耳提取液20 mL(0.556 8 g·mL-1)，分別加入木瓜蛋白酶89.12 mg用HCL分別調pH為6，分別30，40，50，60，70，80，90 ℃水浴90 min后沸水浴10 min使酶滅活，冷卻至室溫，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液加95 %乙醇至醇濃度80 %，3 000 r·min-1離心10 min取沉淀，同法洗滌沉淀3次，測多糖得率,結果見表7，確定最佳酶解溫度為60 ℃。

表7 最適酶解溫度考察結果

2.3.5 工藝驗證 取3個具塞錐形瓶平行做3組，每瓶加入阿魏側耳提取液20 mL(0.556 8g·mL-1)，分別加入木瓜蛋白酶89.12 mg用HCL分別調pH為6，60 ℃水浴90 min后沸水浴10 min使酶滅活，冷卻至室溫，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液加95 %乙醇至醇濃度80 %，3 000 r·min-1離心10 min取沉淀，同法洗滌沉淀3次，測多糖得率分別為3.11 %，3.15 %，3.09 %，RSD=0.8 %(n=3)。

3 討論

影響阿魏側耳多糖提取工藝的各因素重要程度依次為料液比、浸提溫度、浸提時間，且料液比對阿魏側耳多糖提取有顯著性影響。正交分析得到的阿魏側耳多糖提取工藝最佳參數為浸提溫度70℃，浸提時間2h，料液比1∶40。

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StudyonExtractionofPolysaccharideofPleurotusferulae

WANG Ying1，LI Guo-yu1，HUANG Jian2，WEI Xiu-yan2，MA Yue-ping2，GAO Jian-bo1，WANG Jin-hui1,2,3

(1.SchoolofPharmacy,ShiheziUniversity,Shihezi832002,China; 2.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China; 3.KeyLaboratoryofPhytomedicineResources&ModernizationofTCM,Shihezi832002,China)

Objective: Enzymatic hydrolysis processes of polysaccharides fromPleurotusferulaewere investigated.

: Enzymatic hydrolysis processes were developed by determination the concentration of the polysaccharides from by using UV spectrophotometry method. : The enzyme concentration ( mg·g)，time ( ℃)，pH .，and temperature ( min) of hydrolysis processes, was developed. : Enzymatic hydrolysis is powerful for extracting the polysaccharide from .

Enzymatic hydrolysis; polysaccharide; Extraction processes

--)