四黃湯對急性肝損傷小鼠保護作用的研究

蘇治合，溫 飛，蔡 栩，孫智娟，尹 嬌，秦 燕

（1.大理學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；（2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

四黃湯對急性肝損傷小鼠保護作用的研究

蘇治合1，溫 飛1，蔡 栩1，孫智娟1，尹 嬌1，秦 燕2*

（1.大理學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；（2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：探討四黃湯對小鼠急性肝損傷的保護作用。方法：將60只小鼠隨機分為四組，正常對照組15只、模型組15只、四黃湯高劑量組15只（40 g/kg/d生藥）及四黃湯低劑量組15只（20 g/kg/d生藥）。模型組每天灌以相同容積的生理鹽水,連續(xù)2周。最后一次灌胃24 h后，除正常對照組外,所有小鼠以CCl（40.1%10 mL/kg）腹腔注射，禁食不禁水8 h后斷頭取血及肝臟，檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的活性；部分肝組織制備肝勻漿，檢測丙二醛（MDA）的含量，同時取相同部位的肝組織制備病理切片，觀察小鼠肝組織損傷的程度。結(jié)果：急性肝損傷模型組血清ALT的含量明顯高于正常對照組（P＜0.05）；四黃湯低劑量干預(yù)組血清ALT的含量則低于模型組（P＜0.05），而高劑量干預(yù)組血清ALT含量則較模型組偏高（P＜0.05）；模型組肝組織MDA含量高于正常對照組（P＜0.05）；四黃湯低劑量及高劑量干預(yù)組肝組織MDA的含量低于模型組（P＜0.05）。光鏡下四黃湯低劑量干預(yù)組肝細胞損傷程度較急性肝損傷模型組減輕。結(jié)論：四黃湯對小鼠的急性肝損傷具有一定的保護作用。

四黃湯；急性肝損傷；保護作用

急性肝損傷是多種肝病發(fā)生、發(fā)展，最終走向肝功能衰竭的始動環(huán)節(jié)和共同途徑，深入研究其發(fā)病機制及防治新思路對臨床治療肝損傷具有重要的指導(dǎo)意義。肝損傷的發(fā)生與肝細胞膜改變，自由基生成過多和脂質(zhì)過氧化有著密切聯(lián)系〔1-2〕。傳統(tǒng)中藥方劑四黃湯由黃芩、黃連、黃芪、生地黃等10味藥材組成。黃連、黃芩、黃芪具有疏肝解毒，攻積導(dǎo)滯、活血止血、滋陰補肝、息風(fēng)等之功效〔3〕。故本研究通過建立急性肝損傷的小鼠模型，觀察四黃湯對急性肝損傷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性，肝組織丙二醛（MDA）含量以及肝細胞損傷的保護作用，初步闡明四黃湯對急性肝損傷的保護機制，為四黃湯的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑 四黃湯由生地黃、黃芩、黃芪、黃連等10味中藥組成，生藥均購自大理市東駿大藥房，煎煮后過濾、濃縮，置4℃冰箱備用。0.1%四氯化碳（CCl4）購自成都市智遠化工貿(mào)易有限公司，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒和考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物及分組 健康雌性昆明小鼠，3～4月齡，共60只，由大理學(xué)院實驗動物房提供。隨機分為4組，每組15只。其中模型組給予生理鹽水（0.2 mL/10g）灌胃；四黃湯低劑量組：每天灌胃0.2 mL/ 10g（含1 g/mL生藥）；高劑量組：每天灌胃0.2 mL/ 10g（含2 g/mL生藥），持續(xù)2周。最后一次灌藥24 h后，0.1%CCl4溶液行腹腔注射（0.1 mL/10g）。禁食不禁水8 h后斷頭取血及取肝臟，檢測血清ALT的活性；部分肝組織制備肝勻漿，檢測MDA含量。

1.3 主要儀器 RE5002（50 L）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海衛(wèi)凱儀器設(shè)備有限公司）；JY88-Ⅱ超聲波細胞粉碎機（寧波新芝科器研究所）；TGL-18R（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；電子分析天平CVA214C（奧豪斯儀器上海有限公司）；電子制冰機Barline BF320（斯科茨曼制冰系統(tǒng)上海有限公司）。

1.4 病理切片 用10%中性福爾馬林固定肝組織，常規(guī)石蠟包埋，制成石蠟切片。HE染色，觀察肝組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)均用單因素方差分析在SPSS13.0統(tǒng)計軟件中進行處理，結(jié)果用（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 四黃湯對急性肝損傷小鼠血清ALT及肝組織MDA含量的影響 實驗結(jié)果顯示，急性肝損傷模型組血清ALT的含量明顯高于正常對照組（P＜0.05）；四黃湯低劑量干預(yù)組血清ALT的含量則低于模型組（P＜0.05），而高劑量干預(yù)組血清ALT含量則較模型組偏高（P＜0.05）；模型組肝組織MDA含量高于正常對照組（P＜0.05）；四黃湯低劑量及高劑量干預(yù)組肝組織MDA的含量低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各實驗組小鼠血清ALT、肝組織丙二醛（MDA）含量的變化（±s，n=15）

表1 各實驗組小鼠血清ALT、肝組織丙二醛（MDA）含量的變化（±s，n=15）

注：與正常對照組比較：☆P＜0.05，與模型組比較：◆P＜0.05。

2.2 肝組織形態(tài)學(xué)改變 正常對照組肝小葉形態(tài)正常，肝細胞形態(tài)正常（見圖1）。急性肝損傷模型組可見肝小葉內(nèi)大量炎性細胞浸潤，其中以淋巴細胞浸潤為主，肝細胞水腫（見圖2）。四黃湯低劑量干預(yù)組見肝小葉內(nèi)淋巴細胞浸潤，與模型組相比炎性細胞浸潤數(shù)量明顯減少，仍可見肝細胞水腫（見圖3）。高劑量干預(yù)組肝細胞水腫較為明顯，中央靜脈周圍可見片狀肝細胞壞死，炎細胞滲出不明顯（見圖4）。

圖1 正常對照組（HE×200）

圖2 模型組（HE×200）

圖3 低劑量干預(yù)組（HE×200）

圖4 高劑量干預(yù)組（HE×200）

3 討論：

CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是傳統(tǒng)的肝毒模型〔4〕。CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的機制與自由基生成及其啟動的脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)等有關(guān)。CCl4經(jīng)肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的細胞色素氧化酶P450代謝分解產(chǎn)生三氯甲烷超氧自由基（CCl3O2-），CCl3O2-攻擊膜上的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成大量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致膜的流動性和通透性改變，破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和完整性，引起細胞膜結(jié)構(gòu)和功能損害〔5-7〕。

肝細胞損傷時，細胞膜通透性增加，ALT釋放入血，故血清中ALT含量在一定程度上反映了肝細胞受損程度，是反映肝損傷的敏感且最常用的指標〔8〕。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可嚴重破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞腫脹、壞死，含量高低可反應(yīng)氧化的損傷程度〔9〕。本研究結(jié)果顯示模型組小鼠血清ALT的含量明顯升高，提示模型組小鼠肝細胞膜的結(jié)構(gòu)受到損害，膜通透性明顯增加。與此同時肝組織MDA的水平也明顯升高，說明CCl4在體內(nèi)引發(fā)一定量的氧自由基和一定程度的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。低劑量四黃湯干預(yù)組小鼠，其血清ALT的水平較模型組明顯降低，而高劑量干預(yù)組小鼠血清ALT含量與模型組相比，數(shù)值反而升高，二者具有統(tǒng)計學(xué)有意義（P＜0.05），說明一定量的四黃湯對急性肝損傷小鼠的肝細胞具有保護作用，但藥物劑量過大，可能對肝細胞產(chǎn)生毒性作用，使肝細胞的損傷進一步加重。模型組肝組織MDA含量高于正常對照組；而低、高劑量四黃湯干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，兩組均使小鼠肝組織的MDA含量明顯降低。肝組織病理改變也表明四黃湯干預(yù)后的肝組織形態(tài)學(xué)異常改變較模型組減輕，且炎癥細胞浸潤也明顯減少。上述結(jié)果提示一定劑量的四黃湯可能通過提高機體抗氧化能力減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、穩(wěn)定肝細胞膜等途徑，發(fā)揮對小鼠急性肝損傷的保護作用。但藥物劑量過大，則對小鼠肝臟有損害作用，這可能與四黃湯內(nèi)復(fù)雜的化學(xué)成分有關(guān)。因此，四黃湯對肝臟的作用實際是一把“雙刃劍”，有利有弊，如何正確把握劑量，使其揚長避短，更好地服務(wù)于臨床，還有待進一步的研究。

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〔4〕方清茂，張浩，曹毓.藏藥波棱瓜子提取物對肝損傷大鼠的抗氧化作用〔J〕.華西藥學(xué)雜志，2008，23（2）：147-149.

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Protective Effect of Sihuangtang on Acute Hepatic Injury in Mice

SU Zhihe1,WEN Fei1,CAI Xu1,SUN Zhijuan1,YIN Jiao1,QIN Yan2*
（1.School of Clincal Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China; 2.School of Basic Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the protective effect of Sihuangtang on acute hepatic injury in mice and its mechanism. Methods:Sixty mice were randomly divided into 4 groups each with 15,normal control group,model group,Sihuangtang high-dose group(40 g/kg/d crude),and Sihuangtang low-dose group(20 g/kg/d crude).Drug administration was conducted with gastric lavage in different dose everyday for 2 weeks in two treated groups,the same volume of normal saline was applied for model group.Twenty four hours after last gastric lavage,except normal control group,all mice were fasting for 8 hours and then euthanized with intraperitoneal injection of CCl4(0.1%10 mL/kilogram).The levels of alanine aminotransferase(ALT)in the serum,and malonaldehyde(MDA)in the liver were determined.And the pathological examination of liver tissue was observed by optical microscope.Results:The MDA level in the liver and the content of ALT in the serum of acute hepatic injury model group were significant higher than those in normal control group(P＜0.05);compared with the acute hepatic injury model group,the MDA levels in the liver in Sihuangtang low-dose and high-dosage group were both evidently decreased (P＜0.05);and the content of ALT in the serum of Sihuangtang low-dosage group was evidently decreased compared with the model group (P＜0.05),but the content of ALT in the serum increases in Sihuangtang high-dose group compared with the model group (P＜0.05).Under the optical microscope,liver cell injury of the low dose group was evidently slighter than that of the model group.Conclusion:Sihuangtang in certain concentration has protective effecton acute hepatic injury in mice.

Sihuangtang;acute hepatic injury;protective effect

R333.4［文獻標志碼］A［文章編號］1672-2345（2011）12-0044-03

大理學(xué)院大學(xué)生科研基金資助項目（KYSX2010-089）。

2011-06-01

蘇治合，2007級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生.

*通信作者：秦燕，副教授.

（責(zé)任編輯 董 杰）