20（R）-原人參二醇酸水解條件的工藝研究△

楊雅淇，鄭新濤，趙余慶，3*

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032；2.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016；3.基于靶點的藥物設計與研究重點實驗室，遼寧 沈陽 110016）

工藝

20（R）-原人參二醇酸水解條件的工藝研究△

楊雅淇1，鄭新濤2，趙余慶2，3*

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032；2.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016；3.基于靶點的藥物設計與研究重點實驗室，遼寧 沈陽 110016）

目的：優化三七莖葉總皂苷的鹽酸水解工藝，提高水解產物20（R）-原人參二醇 [20（R）-protopanaxadiol，20（R）-PPD]的產率。方法：采用正交試驗設計，考察料液比、鹽酸濃度、水解時間、水解溫度對三七莖葉總皂苷水解過程的影響。結果：影響水解的主次因素依次是鹽酸濃度＞料液比＞水解溫度＞水解時間，優選的最佳工藝為料液比1∶1；鹽酸濃度17.1 mol·L－1，水解時間90 min，水解溫度50℃。結論：采用優化后的水解條件能夠提高PPD的轉化率，適合工業化生產。

三七莖葉總皂苷；鹽酸水解；PPD

三七為五加科植物三七Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根，具有散瘀止血，消腫定痛的功能。三七中含有多種類型的成分，人參皂苷為三七的主要有效成分之一。現代藥理研究表明，三七皂苷可通過直接殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞生長或轉移、誘導腫瘤細胞凋亡或誘導腫瘤細胞分化使其逆轉、增強和刺激機體免疫功能等多種方式起到抗腫瘤作用[1]。正因為三七具有如此顯著的生理活性，近年來成為人們研究的熱點。

研究表明，三七中含有與人參相同或相似的成分。本課題組已有報道從三七莖葉水解產物中分離得到人參二醇（PD），人參三醇（PT），（20R，25S）β，25-epoxy-20，25-cyclodammaran-3β，6α-diol，達瑪烷-20（22）-烯-3β，12β，25-三醇和 20（R）-達瑪烷-3β，12β，20，25-四醇[2-4]。另有文獻報道，以三七莖葉總皂苷為原料經堿水解和酸水解過程分別得到20（S）-原人參二醇和20（R）-原人參二醇（PPD）[5]等20多種活性成分，其中PPD具有較強的抑制癌細胞增長的作用，其誘導細胞凋亡的活性優于已經成功開發為一類新藥的人參皂苷Rg3[6]，PPD化學結構見圖1。

圖1 20（R）-原人參二醇

同時本課題組已報道從三七莖葉水解產物中分得的20（R）-25-OH-PPD和25-OCH3-PPD具有顯著的抗癌活性[7]，它們都與 PPD的結構很相似，所以，如果能夠大量制備PPD，以此為先導化合物進一步結構修飾，制備和尋求活性更強的抗腫瘤化合物，對發現新的活性成分或半合成原料，擴大藥用資源及進行創新藥物的開發研究將具有十分重要的意義。

1 材料

1.1 材料

三七莖葉總皂苷（廣西昌洲天然藥物有限公司）；PPD對照品（含量98%）；鹽酸（分析純）；純凈水。

1.2 儀器

KNAUER高效液相分析色譜儀（德國 KNAUER），Unimicro Technologies蒸發光散射檢測器（上海通微科技有限公司），Kromasil ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm，北京創新科技有限公司），HX502電子天平（慈溪市天東衡器廠），KQ3200DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），DK-98-1電熱恒溫水浴鍋（天津力泰斯儀器有限公司），RE-52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀廠），JC202型電熱恒溫干燥箱（上海成順儀器儀表有限公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（0～25 min，87∶13；25～60min，95∶5）。流速：1.0 mL·min－1，柱溫：25℃，檢測器漂移管溫度：40℃，壓力：2.5×105Pa。進樣量：10μL。

2.2 對照品和供試溶液的配制

稱取干燥至恒重的皂苷元PPD適量，加甲醇制成濃度為 15 mg·mL－1對照品溶液。對照品溶液HPLC圖見圖2。

圖2 PPD對照品HPLC圖

取水解產物樣品適量，精密稱定，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45μm）濾過，得濃度為 10 mg·mL－1的供試品溶液。

2.3 三七莖葉總皂苷鹽酸水解單因素試驗

2.3.1 不同濃度鹽酸對三七莖葉總皂苷水解的影響分別稱取1 g三七莖葉總皂苷，共5份，分別加入濃度為 2.87，6，7.7，9.45，17.1 mol·L－1的鹽酸1 mL，55℃水解1.5 h，水解產物經液相檢測，計算三七莖葉總皂苷水解產物中PPD含量。

2.3.2 不同溫度對三七莖葉總皂苷水解的影響 分別稱取1 g三七莖葉總皂苷，共5份，加入1 mL 17.1 mol·L－1的鹽酸，分別在 45，50，55，60，65℃水解1.5 h，水解產物經液相檢測，計算三七莖葉總皂苷水解產物中PPD含量。

2.3.3 不同水解時間對三七莖葉總皂苷水解的影響分別稱取1 g三七莖葉總皂苷，共5份，加入1 mL 17.1 mol·L－1的鹽酸，在 55℃分別水解 30，40，50，60，90 min，水解產物經液相檢測，計算三七莖葉總皂苷水解產物中PPD含量。

2.3.4 不同料液比對三七莖葉總皂苷水解的影響分別稱取1 g三七莖葉總皂苷，共5份，分別加入濃度為 17.1 mol·L－1的鹽酸0.8，1，1.5，2，2.5 mL，在55℃水解1.5 h，水解產物經液相檢測，計算三七莖葉總皂苷水解產物中總PPD含量。

2.4 三七莖葉總皂苷鹽酸水解正交試驗

根據單因素得出的最佳提取條件，設計4因素3水平正交試驗，并進行極差分析和方差分析。

3 結果與分析

3.1 三七莖葉總皂苷鹽酸水解單因素試驗結果

3.1.1 鹽酸濃度對三七莖葉總皂苷水解產物中PPD含量的影響 圖3反映了不同鹽酸濃度對三七莖葉總皂苷水解產物中PPD含量的影響，可以看出，不同的鹽酸濃度對三七莖葉總皂苷水解的影響很明顯，當鹽酸濃度為17.1 mol·L－1時PPD達到最高值，說明PPD在一定的酸度下才能得到較徹底的水解。

圖3 不同鹽酸濃度對三七莖葉總皂苷水解產物中PPD含量的影響

3.1.2 溫度對三七莖葉總皂苷水解的影響 圖4反映了不同溫度對三七莖葉總皂苷水解的影響，可以看出，當溫度由50℃時，PPD情況達到最好，之后隨著溫度的升高量呈現下降趨勢。

圖4 不同水解溫度對三七莖葉總皂苷水解產物中PPD含量的影響

3.1.3 水解時間對三七莖葉總皂苷水解的影響 圖5反映了不同水解時間對三七莖葉總皂苷水解的影響，可以看出，90 min時水解情況達到最好，之后隨著時間的延長，PPD含量變化幅度趨于平緩。其原因可能是水解基本完全。

3.1.4 料液比對三七莖葉總皂苷水解的影響 圖6反映了不同料液比對三七莖葉總皂苷水解的影響，當料液比為1倍時，PPD情況達到最好，之后隨著料液比的升高量呈現下降趨勢。

圖5 不同水解時間對三七莖葉總皂苷水解產物中PPD含量的影響

圖6 不同料液比對三七莖葉總皂苷水解產物中PPD含量的影響

3.2 三七總皂苷的鹽酸水解的因素水平表

根據單因素實驗考察結果，設計以酸濃度（濃鹽酸）、水解溫度、超聲時間、料液比4個因素3水平的L9（34）正交試驗，結果見表1、2。

表1 三七總皂苷酸水解L9（34）正交試驗

表2 方差結果分析

從結果可以看出，影響PPD含量高低的因素依次為鹽酸濃度＞料液比＞水解溫度＞水解時間。在反應時間、反應溫度和料液比一致的情況下，A3水平PPD得率最高；在鹽酸濃度、反應時間和料液比一致的情況下，B1水平效果最好；鹽酸濃度、反應溫度和料液比一樣的前提下C3水平的效果最佳；在鹽酸濃度、反應溫度和反應時間相同的前提下D2水平效果最好。因此，最終選定A3B1C3D2為三七總皂苷酸水解的最佳工藝，HPLC色譜圖見圖7。

圖7 PPD最佳工藝HPLC圖

4 討論

三七總皂苷是一類活性很好的化合物，具有廣泛的生理活性。這些化合物都是通過運用傳統經典的植化手段和現代色譜技術獲得，其單體皂苷的制備過程通常經過提取、萃取、柱層析等步驟，整個過程顯得比較漫長、繁瑣。目前，有關三七總皂苷及其單體皂苷的研究多集中于提取純化工藝和含量測定方面，水解作為一種獲得三七皂苷單體的手段對其研究還比較少。

三七皂苷的抗腫瘤活性已經得到證實，而PPD的結構與這些活性單體皂苷相似。因此，可以將其作為研究三七皂苷構效關系的先導化合物，進行一定程度上的結構修飾，開發成為抗癌活性更強的新藥，具有潛在的開發和研究價值。

本文在充分積累本課題組前期大量有關三七皂苷及其水解研究的基礎上，首次對三七總皂苷酸水解產物PPD的水解工藝進行了研究，運用單因素考察和正交設計試驗得出了PPD的最佳水解工藝：料液比1∶1；鹽酸濃度17.1 mol·L－1，水解時間 90 min，水解溫度50℃。此條件下PPD的產率最高可達9.7%，非常適合工業化生產。

[1]孫小玲.三七的研究進展[J].云南中醫中藥雜志，2005，26（6）：44-46.

[2]Wei JX，Chang LY，Wang JF，et al.Zwei neue Dammaran-Sapogenine aus den Blattern vonPanax notoginseng[J].Plant Med，1982，45：1672-1711.

[3]胡晗緋，韓凌，趙余慶.三七莖葉皂苷水解產物中稀有抗腫瘤成分的化學研究[J].中國現代中藥，2008，10（4）：6-8.

[4]趙余慶，袁昌魯，傅玉琴，等.人參莖葉中微量三萜化合物的化學研究[J].藥學學報，1990，25（4）：297-301.

[5]陳業高，呂瑜平，桂世鴻，等.三七葉甙制備原人參二醇及其差向異構體[J].精細化工，2003，20（7）：4252-4261.

[6]Wang W，Zhao Y，Rayburn E，et al.In vitro anti-cancer activity and structure-activity relationshi Ps of natural Products i-solated from fruits of Panaxginseng[J].Cancer Chem pharm，2007，59（5）：589-601.

[7]Y，Zhao，W，Wang，L Han.Isolation，Structural Determination，and Evaluation of the Biological Activity of 20（S）-25-methoxyl-dammarane-3β，12β，20-triol[20（S）-25-OCH3-PPD]，a Novel Natural Product fromPanax notoginseng[J].Medicinal Chemistry，2007，3（1）：51-60.

Study on the Technology of Hydrolysis Process of 20（R）-PPD w ith Hydrochloric Acid

YANG Ya-qi1，ZHENG Xin-tao2，ZHAO Yu-qing2，3
（1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110032，China；2.ShenyangPharmaceutical University，Shenyang110016，China；3.KeyLaboratoryofStructure-BasedDrugDesign＆DiscoveryofMinistry ofEducation，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China）

Objective：To optimize the hydrolysis technology of total saponins inPanaxnotoginsengwith hydrochloric acid in order to increase the yield of 20（R）-PPD.Methods：Orthogonal design was used to optimize the hydrolysis condition and four factors including solid/liquid ratio，concentration，reaction time and reaction temperature were investigated to study the process of hydrolysis.Results：The primary and secondary influence factors of this processwere listed as follows：concentration＞solid/liquid ratio＞temperature＞time and the optimization technology of hydrolysis process obtained was：the ratio of liquid to solid material at1∶1，the concentration of hydrochloric acid with 17.1 mol·L－1，and the reaction time and temperaturewere 1.5 h and 50℃ respectively.Conclusion：The yield of20（R）-PPD under the optimum hydrolysis condition was raised and this technology can be used for industrialization production.

Total panax notoginseng saponins；Hydrolysis；PPD

遼寧省天然產物現代分離與工業化制備工程技術中心（2008402021）

*趙余慶，Tel：（027）23986521 E-mail：zyq4885＠126.com

2011-04-06）