HPLC法檢測家兔血漿中地克珠利含量

楊麗萍，高淑霞，張秀玲，孫海濤，姜文學

(山東省農業科學院畜牧獸醫研究所山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南 250100)

地克珠利(Diclazuril)是20世紀80年代由比利時楊森制藥公司開發研制的非聚醚類化學合成抗球蟲藥，屬三嗪類化合物，具有高效、低毒、廣譜的特點，能有效地降低養禽業因球蟲感染帶來的經濟損失［1］，在養兔業中也廣泛用于球蟲病的防治。

食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)和歐盟藥品管理局(European Medicines Agency)分別對地克珠利的毒理學研究數據進行了評估，并推薦了日允許攝入量(Acceptable Daily Intakes)和最高殘留限量(MRLs)，農業部第235號公告也對地克珠利的 MRLs作出規定［2-7］。已有研究多以 HPLC法［1］、毛細管電泳法［8］或 LC-MS/MS［9］法測定了家禽組織中地克珠利的殘留，但目前尚缺乏家兔血漿或組織中地克珠利檢測方法相關的文獻報道。

對家兔血漿中地克珠利的HPLC檢測技術的研究試驗，建立了快速、穩定的家兔血漿中地克珠利的提取方法，為進一步研究地克珠利在家兔組織中的殘留及其規律提供了技術支持。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 液相系統:島津高效液相色譜儀，SPD-10A檢測器，CTO-10A柱溫箱，LC-10AD泵，DGU-4A脫氣裝置，N-2000雙通道色譜工作站;XH-C旋渦混合器(江蘇金壇醫療儀器廠);TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);BP211D電子天平(德國賽多利斯股份有限公司);LD5-2A離心機(北京醫用離心機廠);L-128氮吹濃縮儀(北京來亨科貿有限公司技術開發中心)。

1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純，三乙胺、乙酸、乙酸乙酯、N，N二甲基甲酰胺(DMF)為分析純。對照品地克珠利購自中國獸醫藥品監察所，批號:H0130805，含量為99.7%。妥曲珠利由湖北省武穴市龍翔藥業有限公司生產，批號:090103，含量為98.5%。

2 對照溶液的配制

精密稱取地克珠利10.03 mg，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解后，定容，搖勻，配成濃度為200 μg/mL的地克珠利對照溶液I。取對照溶液I用甲醇逐級稀釋為 180、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562、0.781 μg/mL 的對照溶液。精密稱取妥曲珠利10.11 mg，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解后，定容，搖勻，配成濃度為199 μg/mL的妥曲珠利對照溶液II。取對照溶液II用甲醇稀釋為99.5 μg/mL的內標對照溶液。

3 色譜條件

色譜柱為依利特色譜柱(Hypersil ODS 2.5 μm，250 mm ×4.6mm);C18 保護柱規格為4.0 mm×10 mm(江蘇漢邦科技有限公司);流動相為乙腈∶水∶三乙胺∶冰乙酸 =55 ∶45 ∶0.2 ∶0.12(V/V);流速為1.0 mL/min;柱溫為室溫;紫外檢測波長為240 nm;進樣量為 20 μL。

4 提取方法

取空白血漿0.18 mL，加入地克珠利對照溶液0.02 mL，加入 99.5 μg/mL 的妥曲珠利 0.02 mL，混勻后加入DMF 0.1 mL，渦旋提取30 s，加入乙腈0.2 mL，渦旋提取 30 s，樣品 12 000 r/min 離心 10 min，取上清液進樣20 μL分析。

5 方法學考察

5.1 系統適應性試驗 取空白血漿0.2 mL，除不加地克珠利及妥曲珠利外，按照4所述方法提取，所得空白色譜圖和配制樣品色譜圖見圖1。理論塔板數按地克珠利計算不低于3 000，地克珠利及妥曲珠利與相鄰色譜峰的分離度均大于2.0，拖尾因子分別為 1.01、1.05，出峰時間分別為 7.9 min 和11.1 min。

圖1 典型HPLC色譜圖

5.2 線性關系與檢測限 取空白血漿0.18 mL，加入 1.562、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL地克珠利對照品溶液0.02 mL，使得血漿中地克珠利的濃度為 0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL，加入 99.5 μg/mL 的妥曲珠利0.02 mL，按照4所述方法提取，取上清液進樣20 μL分析。以地克珠利與妥曲珠利峰面積的比值為縱坐標、血漿中地克珠利的濃度為橫坐標進行回歸處理，地克珠利在0.156 ～20.0 μg/mL 濃度范圍內，呈現良好的線性關系。回歸方程為Y=0.183 2x+0.001 0，r=0.999 2。在信噪比 S/N=3 的條件下，血漿中地克珠利的檢測限為0.078 μg/mL。

5.3 回收率與精密度試驗 取空白血漿0.18 mL，加入0.02 mL不同濃度的對照溶液，配制成0.312、5.00、18.00 μg/mL 高、中、低 3 個濃度的對照血漿，按照4所述方法提取，平行操作5份，以血漿標準曲線測得量與地克珠利加入量的比值計算方法回收率。分別于當日和連續3天測定，計算日內和日間精密度，結果見表1。

表1 地克珠利回收率與精密度測定(n=5)

6 討論

6.1 提取方法的選擇 比較了乙酸乙酯萃取、甲醇或乙腈沉淀蛋白、乙腈聯合DMF沉淀蛋白3種提取方法，采用乙酸乙酯液-液萃取法提取血漿中的地克珠利與沉淀蛋白沉淀法相比，雜質較多，血漿中內源性物質影響地克珠利與妥曲珠利的測定，且回收率低;采用甲醇或乙腈沉淀蛋白法對地克珠利與妥曲珠利的檢測無影響，但提取效率不及乙腈聯合DMF沉淀蛋白法的提取效率高。因地克珠利易溶于DMF中，先用DMF提取，為進一步沉淀蛋白，再加入乙腈，使得離心后的樣品不必濾膜過濾，可以直接進樣。

6.2 色譜柱的選擇 比較了不同廠家的色譜柱，考察了 Diamonsil C18(2.5 μm，250 mm ×4.6 mm)和 Hypersil ODS(2.5 μm，250 mm × 4.6 mm)色譜柱。結果地克珠利在各柱上的分析時間接近，但保留行為卻差異很大，Hypersil ODS色譜柱能夠對樣品實現良好的分離。

6.3 流動相的選擇 考察了乙腈∶水(50∶50)和甲醇∶水(70∶30)系統，發現乙腈:水對樣品中組分能實現良好的分離，但地克珠利與妥曲珠利峰脫尾，故采用冰乙酸及三乙胺調整溶液pH值改善峰形。當流動相為乙腈∶水∶三乙胺∶冰乙酸=55∶45∶0.2 ∶0.12(V/V)時，地克珠利及妥曲珠利分離度很好，峰形也很好。

6.4 小結 試驗建立了以妥曲珠利為內標，HPLC法測定家兔血漿中地克珠利含量，該方法具有簡單快速、靈敏的特點，在一定濃度范圍內，線性關系良好，回收率高，無干擾。

［1］施祖灝，朱良強，盧運站，等.雞組織中地克珠利和妥曲珠利殘留 HPLC檢測方法的建立［J］.中國獸醫學報，2009，29(1):79-81.

［2］EMEA.Veterinary Medicines Evaluation Unit:Diclazuril(Extension to All Rum Inants and Porcine Species)，Summary Report(1，2)［R］.1996，2004.

［3］EMEA.Veterinary Medicines Evaluation Unit:Toltrazuril，Summary Report(1)［R］.1998，1999，2000，2004.

［4］JECFA.Toxicological Evaluation of Certain Veterinary Drug Residues in Food:Dielazuril，WHO Food Additives Series 36［R］.Geneva，1996.

［5］JECFA.Toxicological Evaluation of Certain Veterinary Drug Residues in Food Dielazuril，WHO Food Additives Series 41［R］.Geneva，1998.

［6］中華人民共和國農業部公告第235號.動物性食品中獸藥最高殘留限量［S］.

［7］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典(二○○五年版)［S］.

［8］施祖灝，陸俊賢，葛慶聯，等.高效毛細管電泳法同時檢測地克珠利和妥曲珠利的含量［J］.中國獸藥雜志，2008，42(9):13-16.

［9］張 濤，張麗芳，江善祥，等.液相色譜一串聯質譜法測定雞蛋中地克珠利的殘留量［J］.安徽農業科學，2009，37(14):6314-6316.