嗜蟲書虱β-ACTIN基因克隆及定量PCR方法的建立

唐培安 王進軍 宋 偉

(南京財經大學食品科學與工程學院1，南京 210003)

(西南大學重慶市昆蟲學及害蟲控制工程重點實驗室2，重慶 400716)

嗜蟲書虱β-ACTIN基因克隆及定量PCR方法的建立

唐培安1王進軍2宋 偉1

(南京財經大學食品科學與工程學院1，南京 210003)

(西南大學重慶市昆蟲學及害蟲控制工程重點實驗室2，重慶 400716)

旨在建立嗜蟲書虱的實時熒光定量PCR分析方法，為嗜蟲書虱基因的定量分析提供技術支持。利用RT－PCR方法，從嗜蟲書虱體內克隆獲得了β－actin基因cDNA片段(GenBank登錄號:FJ041117)，該基因片段長度為822 bp，編碼273個氨基酸殘基(從第3個堿基開始編碼)。根據此β－actin基因的序列設計引物，建立了基于SYBR Green I染料技術的實時熒光定量PCR方法。建立的嗜蟲書虱β－actin實時熒光定量PCR法擴增效率高、檢測范圍廣、檢測周期短，為β－actin作為內參基因進行嗜蟲書虱功能基因的定量分析奠定了基礎。

嗜蟲書虱 β－actin基因 實時熒光定量PCR 內參基因

實時熒光定量 PCR(quantitative real－time PCR)是20世紀90年代發展起來的一種準確、快速的核酸定量分析技術，是研究基因表達水平最為有用的方法之一［1－2］。實時熒光定量PCR分絕對定量和相對定量，在相對定量檢測中，需要一個內部參照基因，即“內參基因”或稱“看家基因”，對目標基因表達量進行校正，以期獲得真實可靠的結果［3］。內參基因有很多種，常用的有 β －actin、28S rRNA、18S rRNA、GAPDH 和 α －tubulin 等［4－5］。其中，β －actin是構成細胞骨架的主要成分——肌動蛋白的一種，以往的研究結果表明，β－actin具有基因序列高度保守、mRNA表達量高且穩定的特點，常作為內參基因被廣泛應用［6－7］。

儲糧害蟲可造成糧食數量和質量的巨大損失，是威脅我國糧食安全的重要因素［8］。嗜蟲書虱(Liposcelis entomophila Enderlein)隸屬于嚙目(Psocoptera)、書虱科(Liposcelididae)，是一種世界性儲糧害蟲，我國大部分地區都有嗜蟲書虱的分布，通常跟嗜卷書虱、無色書虱和小眼書虱等混合發生［9－10］。自20世紀90年代以來，我國儲糧中書虱類害蟲發生越來越嚴重，在糧庫中經常暴發成災，對糧食安全造成很大的威脅［11－12］。近年來，隨著科技水平的不斷進步，對書虱等儲糧害蟲的研究已進入分子生物學領域［13］。然而，通過搜索 GenBank等數據庫，未發現可用作嗜蟲書虱基因定量分析的內參基因，也未見關于嗜蟲書虱實時熒光定量PCR方法的報道。因此，本研究首先利用RT－PCR方法克隆獲得了嗜蟲書虱β－actin基因cDNA片段，并以此為內參基因建立了實時熒光定量PCR方法，對嗜蟲書虱相關功能基因表達分析研究提供有用的方法學依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 供試書虱

嗜蟲書虱1992年采自重慶市北碚區糧庫，在實驗室(27±1)℃、75% ±5%RH、不予光照、不接受任何藥劑的條件下以全麥粉、酵母粉和脫脂奶粉(10∶1∶1)混合而成的飼料飼養。

1．1．2 主要儀器和試劑

Mx3000PTM實時熒光定量PCR儀、Brilliant SYBR Green QPCR Master mix:美國Agilent Stratagene公司;Mastercycler?PCR儀:德國Eppendorf公司;TRIzol試劑:美國invitrogen公司;PrimeScriptTMRT－PCR Kit、Taq DNA聚合酶、pMD18－T vector:TaKaRa公司;Gel Extraction Mini Kit:上海華舜生物工程有限公司。

1．2 方法

1．2．1 引物設計

根據已報道的其它物種的β－actin氨基酸序列用DNAMAN軟件進行多重比對，找出保守序列，并據此保守序列設計簡并引物:

上游引物:5'-GNCARAARGAYWSNTAYGTNGG-3'下游引物:5'-GNGCNARNGCNGTDATYTCYTT-3'根據試驗中克隆獲得的嗜蟲書虱β－actin基因片段，使用Primer 3．0在線引物設計軟件(http://frodo．wi．mit．edu/primer3/)設計 real－ time PCR 引物，其序列如下:上游引物:5'-CTTGACGGAGCGTGGTTATT-3'下游引物:5'-ACCGATGGTGATTACTTGACC-3'

1．2．2 總RNA的提取與反轉錄

用TRIzol試劑從嗜蟲書虱體內提取總RNA，所有操作按試劑盒說明書進行;cDNA合成按Prime-ScriptTMRT－PCR Kit說明書進行。

1．2．3 PCR反應及其產物的克隆與測序

利用上述簡并引物PCR擴增后，產物經瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，利用膠回收試劑盒對目的電泳條帶進行回收純化，純化產物克隆到pMD18－T質粒載體中，用通用引物進行序列測定，所有測序工作由上海英俊生物公司完成。

1．2．4 序列分析

多重序列比對和氨基酸序列的推導使用DNAMAN軟件完成，BLAST同源性搜索在美國國家生物技術信息中心(NCBI)站點完成。

1．2．5 實時熒光定量PCR條件的優化

采用SYBR Green I染料法，在Mx3000PTM實時熒光定量PCR儀上進行擴增和數據分析，以最小的Ct值和最高的熒光值為標準，分別對循環條件、退火溫度、引物濃度進行優化。

1．2．6 熔解曲線分析

為排除形成二聚體及非特異性擴增產物對實時熒光定量PCR結果造成影響的可能性，在PCR后進行熔解曲線分析，以確定得到的產物為單一的目的產物。溫度以0．5℃/10 s的速度從60℃緩慢遞增到95℃，連續測定樣品的熒光強度以獲取熔解曲線。

1．2．7 標準品的制備及標準曲線的建立

以總RNA反轉錄的cDNA為模板，利用上述定量PCR引物對嗜蟲書虱β－actin基因進行常規PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，利用膠回收試劑盒對目的電泳條帶進行回收純化。對純化的目的片段進行5倍系列稀釋，以優化的反應條件進行實時熒光定量 PCR，以相對拷貝數的對數為橫坐標，以Ct值為縱坐標建立相對定量標準曲線。

2 結果與分析

2．1 嗜蟲書虱β－actin基因cDNA片段的克隆及序列分析

圖1 嗜蟲書虱β－actin基因片段核苷酸序列及其推導的氨基酸序列

圖2 嗜蟲書虱與其它昆蟲β－actin基因片段核苷酸序列的多重比對

以抽提的嗜蟲書虱總RNA為模板，用反轉錄試劑盒進行cDNA的合成，用設計的簡并引物進行擴增，獲得了一條約為820bp的基因片段，經酶切和PCR鑒定后進行基因序列測定，得到嗜蟲書虱βactin基因 cDNA的片段(GenBank登錄號:FJ 041117)。該基因片段長度為822 bp，編碼273個氨基酸殘基(從第3個堿基開始編碼)，其核苷酸序列及推導的氨基酸序列見圖1。將嗜蟲書虱β－actin基因的核苷酸序列進行BLAST搜索比對，發現嗜蟲書虱β－actin基因與其他昆蟲的β－actin具有很高的同源性，它與小眼書虱(Liposcelis paeta，GQ449384)、嗜卷書虱(Liposcelis bostrychophila，FJ196622)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，DQ440059)、家 蠶 (Bombyx mori，HQ918291)、白紋伊蚊(Aedes albopictus，DQ657949)、美國牧草盲蝽(Lygus Lineolaris，DQ386914)的β－ac-tin同源性分別高達89%、88%、83%、83%、83%和84%，表明該基因在不同物種間具有高度的保守性(圖2)。

2．2 標準品的制備及標準曲線

PCR產物經回收純化后作為標準品，進行5倍系列稀釋，采用優化的條件進行實時熒光定量PCR，以Ct值為縱坐標，以相對拷貝數的對數為橫坐標，獲得相對定量標準曲線(圖3)，結果表明，本方法有很好的相關性，其 Ct值與模板濃度的回歸方程為Y= －1．426Log(x)+21．42，Y 為 Ct值，x為模板濃度，其相關系數為0．989，擴增效率為97．5%。

圖3 β－actin基因的標準曲線

2．3 熔解曲線

擴增產物的熔解曲線只有一個特異峰，表明產物是唯一的，無引物二聚體和非特異性擴增產物，說明本實驗設計的定量PCR引物具有很好的特異性，PCR反應條件得到了較好的優化。

圖4 熔解曲線分析

3 討論與結論

近年來，書虱作為一類重要的儲糧害蟲引起科學家們的重視，對其研究也逐步深入到分子生物學領域［13］。Tang等從嗜蟲書虱體內克隆獲得了2條乙酰膽堿酯酶基因(AChE)［14］;Jiang等從嗜卷書虱體內克隆獲得了2條多功能氧化酶基因(P450)，并利用實時熒光定量PCR方法比較了2條基因在不同蟲態之間的轉錄水平［15］;Wu等［16］從小眼書虱體內克隆獲得了1條乙酰膽堿酯酶基因(AChE)，利用實時熒光定量PCR方法比較不同地理品系之間的轉錄水平，研究其分子水平的多態性。采用實時熒光定量PCR技術可以比較昆蟲不同品系、不同組織或不同個體間基因表達的差異，從分子水平上揭示害蟲抗藥性產生機理，以此建立抗藥性分子診斷技術，還可以針對變化了的分子結構設計特定的靶標殺蟲劑，為有害生物的綜合治理提供技術支撐［17－20］。然而，目前尚未見到有關嗜蟲書虱內參基因的研究報道。為了給嗜蟲書虱基因表達的定量分析提供必要的方法手段，本研究克隆獲得了嗜蟲書虱β－actin基因cDNA片段，并以此為內參基因建立了基于SYBR Green染料技術的嗜蟲書虱實時熒光定量PCR方法。結果表明，利用嗜蟲書虱β－actin基因(GenBank登錄號:FJ041117)為內參基因，利用本研究設計的定量PCR引物所建立的方法具有快速(從RNA提取到PCR結束在4 h內完成)、高通量(一次可同時檢測90多個樣本)、線性范圍廣以及重復性強等特點，從而為β－actin作為內參基因對嗜蟲書虱相關基因的實時熒光定量PCR分析提供了有利的方法學基礎。

［1］Radonic A，Thulke S，Mackay I M，et al．Guideline to reference gene selection for quantitative real－ time PCR［J］．Biochemical and Biophysical Research Communications，2004，313(4):856－862

［2］陳旭，齊鳳坤，康立功，等．實時熒光定量PCR技術研究進展及其應用［J］．東北農業大學學報，2010，41(8):148 －155

［3］廉紅霞，高騰云，傅彤，等．實時熒光定量PCR定量方法研究進展［J］．江西農業學報，2010，22(10):128－129

［4］Bower N I，Moser R J，Hill J R，et al．Universal reference method for real－time PCR gene expression analysis of preimplantation embryos［J］．BioTechniques，2007，42:199 － 206

［5］陳鳳花，王琳，胡麗華．實時熒光定量RT－PCR內參基因的選擇［J］．臨床檢測雜志，2005，23:393 －395

［6］Jung M，Ramankulov A，Roigas J，et al．In search of suitable reference genes for gene expression studies of human renal cell carcinoma by real－ time PCR［J］．BMC Molecular Biology，2007，8(1):47

［7］趙文靜，徐潔，包秋華，等．實時熒光定量PCR中內參基因的選擇［J］．微生物學通報，2010，37(12):1825 －1829

［8］曹陽，齊朝富，李光濤，等．2．5%菜喜懸浮劑(spinosad)對三種儲糧害蟲的毒力測定［J］．中國糧油學報，2007，22(4):99－101

［9］Nayak M K，Daglish G J．Potential of imidacloprid to control four species of psocids(Psocoptera:Liposcelididae)infesting stored grain［J］．Pest Management Science，2006，62(7):646－650

［10］呂建華，趙英杰，魯玉杰．三種植物精油對四種主要儲糧害蟲的生物活性研究［J］．中國糧油學報，2006，21(3):325－329

［11］Chai Y X，Liu G Y，Wang J J．Toxicological and Biochemical Characterizations of AChE in Liposcelis bostrychophila Badonnel(Psocoptera:Liposcelididae)［J］．Pesticide Biochemistry and Physiology，2007，88(2):197 －202

［12］白春啟，曹陽，李燕羽，等．小眼書虱Liposcelis paeta(Psocopotera:Liposcelididae)表皮層脂類成分分析［J］．中國糧油學報，2008，23(5):128 －131

［13］趙朔，李志紅，秦萌．書虱及其分子生物學研究進展［J］．植物保護，2009，35(6):17 －21

［14］Tang P A，Jiang H B，Xu Y Q，et al．Molecular Characterization of Two Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunits from Liposcelis bostrychophila Badonnel(Psocoptera:Liposcelididae)［J］．Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2009，72(1):34 －47

［15］Jiang H B，Tang P A，Xu Y Q，et al．Molecular characterization of two novel deltamethrin－inducible P 450 genes from Liposcelis bostrychophila Badonnel(Psocoptera:Liposcelididae)［J］．Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2010，74(1):17 －37

［16］Wu S，Ming Li，Tang P A，et al．Cloning and characterization of acetylcholinesterase 1 genes from insecticide－resistant field populations of Liposcelis paeta Pearman(Psocoptera:Liposcelididae)［J］．Insect Biochemistry and Molecular Biology，2010，40(5):415 －424

［17］Baxter G D，Barker S C．Analysis of the sequence and expression of a second putative acetylcholinesterase cDNA from organophosphate－susceptible and organophosphateresistant cattle ticks［J］．Insect Biochemistry and Molecular Biology，2002，32(7):815 － 820

［18］Criniti A，Mazzoni E，Cassanelli S，et al．Biochemical and molecular diagnosis of insecticide resistance conferred by esterase，MACE，kdr and super－ kdr based mechanisms in I-talian strains of the peach potato aphid，Myzus persicae(Sulzer)［J］．Pesticide Biochemistry and Physiology，2008，90(3):168－174

［19］Gao J R，Zhu K Y．Increased expression of an acetylcholinesterase gene may confer organophosphate resistance in the greenbug，Schizaphis graminum(Homoptera:Aphididae)［J］．Pesticide Biochemistry and Physiology，2002，73(3):164－173

［20］Jiang H B，Liu Y H，Tang P A，et al．Validation of endogenous reference genes for insecticide－induced and developmental expression profiling of Liposcelis bostsrychophila(Psocoptera:Liposcelididae)［J］．Molecular Biology Reports，2010，37(2):1019 －1029．

Cloning of β－actin Gene and Establishment of Quantitative Real－time PCR from Liposcelis Entomophila

Tang Peian1Wang Jinjun2Song Wei1

(School of Food Science and Engineering，Nanjing University of Finance and Economics1，Nanjing 210003)

(Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering of Chongqing，Southwest University2，Chongqing 400716)

The purpose of this study was to establish a quantitative real－time PCR method for Liposcelis entomophila and provide useful methodological basis for quantitative analysis of L．entomophila genes．The sequence of the β－actin gene cDNA fragment of Liposcelis entomophila was amplified by reverse transcript polymerase chain reaction(RT－PCR)，which contained 822 base pairs(bp)and encoded 273 amino acid(GenBank accession number:FJ041117)．According to the sequence of β －actin gene above，a quantitative real－time PCR method based on SYBR Green I dye was developed．The results showed that the quantitative real－time PCR method established in the study had the advantages of high efficiency，wide linear range and less time．The results of this study might provide a basis for β － actin used as a reference gene to analyze the Liposcelis entomophila gene quantitatively．

Liposcelis entomophila，β－actin，quantitative real－time PCR，reference gene

Q786

A

1003－0174(2011)11－0071－05

時間:2011－10－25 10:17

網絡出版地址:http://www．cnki．net/kcms/detail/11．2864．TS．20111025．1017．002．html

CNKI:11 －2864/TS．20111025．1017．002

國家自然科學基金(31000828)

2011－01－18

唐培安，男，1981年出生，講師，儲藏物昆蟲學