p16與eIF4E在宮頸癌中基因改變情況的初步研究

鄭曉娟 胡新榮 唐澤立 李飛虹 龐天云

宮頸癌是嚴重危害婦女生命健康的惡性腫瘤，全球發病率居第二位，在我國則是婦科惡性腫瘤的第一位死亡原因。宮頸癌起源于正常宮頸上皮，進而發展為宮頸上皮內瘤變(CIN)，再經過幾年或十幾年可發展為浸潤癌［1，2］。因此，尋找與宮頸癌發生發展有關的分子標志，是早期提示、診斷宮頸癌的關鍵。p16與宮頸癌的關系是近年來這一研究領域的熱點。eIF4E位于宮頸腫瘤LOH常發生的染色體之一的4q24，cDNA長1 683 bp。在宮頸腫瘤中eIF4E的基因型究竟為何種改變尚不清楚。本實驗運用PCR技術對宮頸癌中p16及eIF4E進行檢測，以期發現與宮頸癌的發生發展相關的分子標志。

1 材料與方法

1.1 標本來源及處理

本研究資料取自廣東醫學院附屬醫院婦產科2004～2006年間手術切除的41例新鮮宮頸癌標本。新鮮組織自患者體內取出后，立即送病理科由經驗豐富的病理科醫師取材，取材內容包括宮頸癌組織和癌旁正常宮頸組織，并裝入凍存管中，置于－80℃冰箱密封保存備用。切片時置于－20℃冷凍切片機中，6～8 μm連續切片，切片亦置于－80℃低溫冰箱中保存備用。

1.2 主要試劑

微量DNA提取試劑盒，p16exon1、eIF4E的引物，瓊脂糖凝膠，50 bp DNA ladder，溴化乙錠(EB)。

實驗所用引物為B-globin(產物長度:102 bp):S 5 ＇-gTg CAT CTg ACT CCT gAg gAg A-3 ＇，A 5 ＇-CCT TgA TAC CAA CCT gCC CAg-3＇;p16exon1(產物長度:269bp):S 5 ＇-CCT TgC CTg gAA AgA TAC Cg-3 ＇，A 5 ＇-gCA CCT CCT CTA CCC gAC CC-3＇;eIF4E(產物長度:244bp):S 5 ＇-AAA Cgg AAT CTA ATC Agg Ag-3 ＇，A 5 ＇-CAC ATA ggC TCA ATA CCA TC-3＇。

1.3 主要儀器

倒置顯微鏡，臺式離心機，752型紫外分光光度計，PCR擴增儀，穩壓穩流電泳儀，紫外透射分析儀。

1.4 實驗方法

選取正常宮頸組織和宮頸癌這兩個起始端和終端，檢測如下2個基因:p16exon1，eIF4E。將蘇木精輕染的宮頸癌切片置于倒置顯微鏡載物臺上，10倍鏡下手持清潔手術刀片在需要切割的區域來回刻劃，用刀片蘸取少量裂解液黏取游離的細胞，將其轉移到裝有200 μl裂解液的凍存管中，細胞大約蓋滿管底即可，然后使用微量DNA提取試劑盒提取制備DNA。將每一例樣本的正常宮頸組織和癌組織進行配對，測定所提取宮頸癌組織及癌旁正常組織DNA的OD值，在25 μl的PCR反應體系中，均統一加入0.8 μg模板DNA。在同一批次分別針對待檢基因和相應的看家基因做PCR，電泳時在同1個加樣孔中分別加入兩種產物各8 μl，待電泳結束后，對凝膠進行染色。按照同樣的方法對上述2個基因各重復檢測2次。

1.5 電泳圖像分析

運用bandscan4.3對電泳圖像中的各個泳帶進行灰度掃描，取兩次實驗灰度值的均值。計算出待檢基因擴增產物灰度值與相應看家基因擴增產物灰度值的比值，以這一比值作為校正值(相對灰度)，運用SPSS13.0進行統計學分析，根據處理結果確定基因的擴增或丟失情況。

2 結果

抑癌基因p16exon1在宮頸癌中的拷貝數改變:p16exon1在宮頸癌組織中相對灰度的均值為0.28，在正常宮頸組織中相對灰度的均值為0.11。經配對樣本 t檢驗，t= －2.766，P(雙)=0.028，兩者相比有統計學意義，見圖1。

癌基因eIF4E在宮頸癌中的拷貝數改變:eIF4E在宮頸癌組織中相對灰度的均值為1.08，在正常宮頸組織中相對灰度的均值為0.72。經配對樣本t檢驗，t= －2.744，P(雙)=0.029，兩者相比有統計學意義，見圖2。

以下電泳圖中相鄰兩泳道為同一例樣本，奇數泳道為正常組織，偶數泳道為癌組織，“M”為50 bp DNA ladder。

圖1 正常宮頸組織與宮頸癌中p16exon1的基因擴增情況

圖2 正常宮頸組織與宮頸癌中eIF4E的基因擴增情況

3 討論

本實驗結果顯示，p16exon1在宮頸癌組織中擴增產物的拷貝數較癌旁正常組織明顯增加，兩者相比有統計學意義。從中初步推斷，p16的第1個外顯子參與了宮頸癌的發生發展。這從基因水平上解釋了p16蛋白表達增高的原因。以往大多是用免疫組化的方法檢測p16蛋白的表達情況，發現p16蛋白的表達隨著宮頸病變發展程度的增高，其累積量也逐漸增高，但這并不能揭示p16基因的結構異常。本實驗結果說明，p16exon1的基因結構發生了改變，表現為擴增，由此可引起其蛋白表達的增高。p16的第2、3個外顯子是否也是同樣的情況，尚需進一步檢測。

迄今，在宮頸癌的發生發展過程中，對于p16在基因水平方面的報道還比較有限。Wong等［3］研究了128例宮頸癌中p16的缺失情況，發現其中7例有純合性缺失，比例為5%。亦有文獻報道，采用PCR的方法對p16的第1和第2個外顯子進行了純合性缺失檢測，得出如下結果，在60例宮頸癌中，9例有第1或第2個外顯子的純合性缺失，比例為15%［4］。本實驗即是對p16在分子水平方面的改變進行了初步研究，后續仍有極大的研究空間，可進行更深入的探索。

eIF4E即真核細胞翻譯起始因子4E，與蛋白合成的起始反應有關，其活性受ras，c-myc等基因的正性調控。在實體腫瘤發展中，惡性組織的增殖需要大量蛋白的合成，eIF4E表達增高屬必然事件。eIF4E作為原癌基因，其作用是通過加強各種原癌基因的翻譯而實現的。Lee等［5］運用免疫組化的方法發現，eIF4E在正常宮頸鱗狀上皮中沒有表達，隨著宮頸病變的級別增高，其表達逐漸增強，且其表達具有顯著統計學意義;同時運用實時定量反轉錄PCR檢測發現，在宮頸腫瘤中eIF4E的表達較正常宮頸上皮明顯增強，其差異亦有顯著統計學意義。也有文獻報道，eIF4E在宮頸腫瘤中的表達增加，并可促進HPV E7基因的表達［6］。這些都表現了它作為癌基因的特性。本實驗結果顯示，eIF4E在宮頸癌組織中較癌旁正常組織中擴增產物的拷貝數明顯增加，兩者相比有統計學意義。從中初步推斷，與正常宮頸組織相比，eIF4E在宮頸癌中表現為擴增;并可推測其蛋白在宮頸癌中亦為過量表達。從eIF4E本身的特性(為癌基因)來講，我們較容易理解其表現為擴增的事實。目前尚未見到有具體研究eIF4E的基因型改變的報道。

本實驗從基因結構的改變方面表明了p16可以作為宮頸癌發生發展的有用的分子標志。目前在宮頸癌的研究中，有關eIF4E的報道較少，在本實驗中亦是對其進行初步研究，根據實驗結果，可初步考慮把該基因作為宮頸癌發生發展過程中的候選分子標志。p16第2、3個外顯子在宮頸癌中的基因改變情況如何，以及eIF4E是否可作為宮頸癌發生發展方向的確切分子標志，尚需進一步研究。

［1］Spitzer M，Apgar B，Brotzman G.Management of histologic abnormalities of the cervix〔J〕.Am Fam Physician，2006，73(1):105.

［2］Lau S，Franco EL.Management of low-grade cervical lesions in young women〔J〕.CMAJ，2005，173(7):771.

［3］Wong YF，Chung TK，Cheung TH，et al.p16INK4 and p15-INK4B alterations in primary gynecologic malignancy〔J〕.Gynecol Oncol，1997，65(2):319.

［4］Yuan JR，Li Y，Hu SJ，et al.Methylation and aberrant expression of thep16 gene in cervical carcinoma〔J〕.HEREDITAS(Beijing)，2005，27(1):39.

［5］Lee JW，Choi JJ，Lee KM，et al.eIF-4E expression is associated with histopathologic grades in cervical neoplasia〔J〕.Hum Pathol，2005，36(11):1197.

［6］Matthews-Greer J，Caldito G，de Benedetti A，et al.eIF4E as a marker for cervical neoplasia〔J〕.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2005，3(4):367.