p16基因在乳腺浸潤性導管癌中甲基化的研究

范昭 葉靜 龍霞 張信

腫瘤表觀遺傳學是一門新興科學，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑、基因組印跡和非編碼RNA調控等幾個方面。其中，DNA甲基化與腫瘤的關系是研究的熱點。近年來，日益增多的研究表明腫瘤的發生、進展和轉移與DNA甲基化密切相關。p16基因作為抑癌基因，其第1外顯子5'啟動子區域CpG島的甲基化在多種腫瘤的發生發展中起重要作用［1］。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應法(methylation-specific PCR，MSP)，檢測乳腺浸潤性導管癌組織及乳腺非癌組織中p16基因的甲基化狀態，以探討p16基因甲基化在乳腺癌發生中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集我院甲狀腺乳腺外科2007年3～10個月，手術切除的新鮮乳腺浸潤性導管癌組織共42例，作為癌癥組;對照組為21例乳腺良性病變旁正常乳腺組織，包括纖維腺瘤19例和乳管內乳頭狀瘤2例，此外，對照組還包括癌旁正常乳腺組織3例。所有病例均為女性，年齡19～70歲，平均35.6歲，術前均未接受過放化療，并經病理組織學檢查證實，－80℃速凍保存。

1.2 方法

1.2.1 組織DNA提取 按照QIAamp DNA Mini Kits 51304試劑盒(Qiagen公司)說明書進行操作，紫外分光光度儀檢測其含量和純度。

1.2.2 甲基化修飾 所有標本DNA均取1.0μg進行甲基化修飾，操作流程參照CpGenome TM DNA Modification Kit S7820(Chemicon公司)甲基化試劑盒說明書，修飾后的DNA分裝儲存。

1.2.3 MSP擴增 PCR反應試劑盒為2×PCR Master mix K0171(Fermentas公司):2×PCR Master mix 12.5 μl，上下游引物各 1 μl(10 pmol/μl)，甲基化后的DNA2 μl，用水補至 25 μl。p16 基因擴增采用巢式PCR，第一輪PCR擴增條件:95℃預變性5 min，95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，循環 35 個周期后，最后 72℃ 延伸 8 min。巢式 PCR引物，F:5'-GAAGAAAGAGGAGGGTTGG-3'，R:5'-CTACAAAC CCTCTACCCACC-3'。取 PCR 產物 0.3 μl做第二輪PCR，p16(甲基化與非甲基化)擴增條件:95℃預變性5 min，95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環30個周期，最后72℃延伸8 min。產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。p16甲基化引物，MF:5'-TTATTAGAGG GTGGGGCGGATCGC-3'，MR:5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3'，片段大小為 150 bp;非甲基化引物，UF:5'-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3'，UR:5'-CAACCCCAAACCA CAACCATAA-3'，片段大小為151 bp。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 統計學分析

采用SPSS13.00軟件進行統計學處理，應用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

42例散發性乳腺浸潤性導管癌中，有18例檢測到p16基因啟動子甲基化，甲基化率為42.9%;24例乳腺非癌組織中檢測到2例(均為乳腺纖維腺瘤)甲基化，甲基化率為8.3%;其中3例癌旁正常組織甲基化均為陰性，對應的癌組織有2例甲基化陽性，1例甲基化陰性。經統計學分析，p16基因啟動子的甲基化率乳腺癌組與非癌組比較差異有顯著性(χ2=8.619，P ＜0.05)，見圖 1。

圖1 p16基因在乳腺癌和非癌組織中的甲基化情況

3 討論

乳腺癌的發生、發展及轉移與細胞周期調控異常密切相關，特別是G1期相關的各種因子，包括正向調節作用的細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶;負向調節作用的細胞周期蛋白依賴性因子、抑癌基因產物，這些蛋白可以獨立或協同促進或抑制惡性腫瘤的發生和發展。p16基因是人類發現的第1個直接參與細胞周期調控的抑癌基因，屬于細胞周期蛋白依賴性激酶基因家族，是細胞周期負調控基因。p16蛋白能與周期蛋白競爭結合細胞周期素依賴酶(CDK4、6)，從而抑制細胞周期素D與CDK復合物的活性，阻止細胞進入G1/S期，對細胞周期起反向調節作用，抑制細胞的分裂與增殖。若失去p16蛋白的抑制作用，細胞會異常增生、分裂，最終失去控制，導致腫瘤的發生。

研究證實在原發性腫瘤中p16基因突變、缺失率相對較低，而甲基化發生頻率很高。基因異常甲基化是人類腫瘤早期發生的1個重要事件，p16基因甲基化存在于大多數腫瘤中，如子宮內膜癌、胰腺癌、肺癌及白血病中都有報道。Wong等［2］采用MSP方法，對48例乳腺癌石蠟標本進行檢測，p16基因甲基化率為27.1%，有淋巴結及遠處轉移的甲基化率高于無轉移的甲基化率。發生甲基化的標本p16蛋白失表達率高于非甲基化病例，認為p16基因超甲基化是乳腺癌中常見的分子生物學改變之一，其超甲基化和乳腺癌浸潤及轉移有相關性;甲基化是p16基因失活的主要方式之一。但該研究沒有對非癌組織進行甲基化檢測。在Jing等研究中同樣證明了乳腺癌中p16基因超甲基化是其mRNA和蛋白失表達的主要原因［3］。隨后，Dominguez等［4］和 Munot等［5］也采用 MSP 方法對大量乳腺癌患者進行p16基因的甲基化檢測，甲基化率分別為19%(19/100)和 50%(100/200)。Vallian 等［6］采用MSP和重復序列PCR(PCR-REP)2種方法，對伊朗乳腺癌患者進行p16基因甲基化檢測，甲基化率分別為35.7%和40%，2種方法研究結果相差不大，他們認為在伊朗乳腺癌患者中p16基因超甲基化是早期常見的事件，可將p16基因甲基化狀態用在伊朗乳腺癌患者診斷和治療上。在我們研究中，p16基因在散發性乳腺浸潤性導管癌中甲基化率為42.9%，與大多數研究結果一致。我們在24例乳腺非癌組織中除了2例乳腺纖維腺瘤檢測出甲基化，其余均未發生甲基化，兩組間差異有統計學意義，說明p16基因甲基化對于乳腺癌的臨床早期診斷具有一定指導意義。由于收集的癌組織標本均為浸潤性導管癌，并且多數為Ⅰ期，故未進行甲基化與臨床病理特性相關性分析。

近年來，研究發現腫瘤患者血漿中存在來源于腫瘤細胞的游離DNA，在癌癥發生過程中涉及一系列基因突變及甲基化的改變，為診斷提供分子標記。血漿DNA具有取材方便和無創性等特點，通過檢測這些分子標記為腫瘤的早期診斷及病情監控提供可行性。p16基因在乳腺癌患者外周血中甲基化檢測的研究也有報道。同時收集61例乳腺癌患者血漿與相應組織標本，應用MSP技術，檢測p16基因甲基化狀態。61例乳腺癌患者血漿和相應癌組織中，p16基因的甲基化檢出率分別為44.3%和46.2%，兩者檢出率無統計學差異［7］。Feng等［8］研究檢測到 p16基因在散發性乳腺癌患者血漿標本中甲基化率為25.4%，與相應癌組織標本中甲基化率28.6%相差不大，進一步說明p16基因很可能成為乳腺癌診斷的分子標記物，具有臨床應用的價值。

［1］Bian YS，Osterheld MC，Fontolliet C，et al.p16 inactivation by methylation of the GDKN2A promoter occurs early during neop1astic pmgression in Barrett’s esophagus〔J〕.Gastroente-rology，2002，l22(4):1113.

［2］Wong SC，Chan J K，Lee K C，et al.Differential expression of p16/p21/p27 and cyclin D1/D3，and their relationships to cell proliferation，apoptosis，and tumour progression in invasive ductal carcinoma of the breast〔J〕.J Pathol，2001，194(1):35.

［3］Jing F，Jun L，Yong Z，et al.Multigene methylation in serum of sporadic Chinese female breast cancer patients as a prognostic biomarker〔J〕.Oncology，2008，75(1-2):60.

［4］Dominguez G，Silva J，Garcia JM，et al.Prevalence of aberrant methylation of p14ARF over p16INK4a in some human primary tumors〔J〕.Mutat Res，2003，530(1 ～2):9.

［5］Munot K，Bell SM，Lane S，et al.Pattern of expression of genes linked to epigenetic silencing in human breast cancer〔J〕.Hum Pathol，2006，37(8):989.

［6］Vallian S，Sedaghat M，Nassiri I，et al.Methylation status of p16INK4A tumor suppressor gene in Iranian patients with sporadic breast cancer〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2009，135(8):991.

［7］今 毅，謝 文，余小萍，等.乳腺癌患者腫瘤循環DNA的定量分析〔J〕.第四軍醫大學學報，2007，28(11):1024.

［8］Feng J，Hu LH，Lu J，et al.Diagnostic value of BRCA1 and p16 gene methylation in sporadic breast cancer〔J〕.Chin J Cancer，2009，28(4):436.