隱匿性HBV感染者血清中HBV S基因變異分析

張玲榮，馬 媛，郝彥琴，朱新宇 (山西醫科大學第一臨床醫學院感染病科，太原 030001;通訊作者，E-mail:zxy6608056@163.com)

隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult HBV infection，OBI)是HBV感染的特殊形式，是臨床和流行病學的一大難題，影響對HBV的診斷，導致臨床漏檢及獻血員篩檢錯誤，可造成HBV傳播，并與肝硬化、肝癌相關。目前隱匿性HBV感染的機制尚不清楚。本文對不明原因的肝病患者血清標本進行巢式PCR擴增，對擴增的HBV S基因進行序列分析，旨在從基因變異角度分析HBV隱匿性感染的分子機制。

1 材料與方法

1.1 病例選擇及血清收集 76例均為2010－07～2011－03在山西醫科大學第一臨床醫學院因不明原因肝病住院的患者，其中男性47例，女性29例，年齡32－69歲，平均年齡(48.22 ±16.33)歲;病程1－9年;其中慢性肝炎31例，肝硬化41例，肝癌4例。入選患者包括血清乙肝病毒表面標志物(HBVM)均陰性和單個或者多個抗體陽性者。所有患者排除其他病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病、藥物性肝病及代謝性肝病等。收集10例HBV DNA載量為106copy/ml乙肝患者為陽性對照。

清晨空腹采肘靜脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，取上清，置于－20℃待檢。

1.2 主要試劑與儀器 TaqDNA聚合酶、dNTP購自大連寶生物公司;ELISA試劑購自美國Abbott公司;病毒核酸提取試劑盒購自美國OMEGA公司;Tanon Gis-2010全自動圖像處理系統為天能科技(上海)有限公司產品，PTC-100型PCR擴增儀為美國MJ公司產品。

1.3 引物設計與合成 選擇HBV基因組中保守的S區。外側引物:上游引物 5'－CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC－3'，下游引物5'－ATACCCAAAGACAAAAGAAAA－3';內側引物:上游引物 5'－GCGGGTTTTTCTTGTTGAC－3'，下游引物 5'－GGGACTCAAGATGTTGTACA－3';產物條帶為564 bp。

1.4 病毒核酸的提取與擴增 患者及陽性對照血清均采用柱吸附法提取HBV DNA，應用巢式PCR方法擴增nt56－nt767 HBV S區DNA片段，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 基因測序 從血清HBV DNA陽性者中隨機抽取8例測序，測序范圍為HBV S基因序列nt56－nt767，包括aa決定簇(124－147aa，nt524－nt595)，測序工作由大連寶生物公司完成。

2 結果

不明原因肝病患者血清HBV DNA S區擴增結果見圖1，目的條帶位于500 bp－700 bp之間。76例不明原因肝病患者中16例血清HBVDNA陽性，陽性率21%。

圖1 不明原因肝病患者血清HBV DNA S區巢式PCR反應電泳結果圖

8例隱匿性HBV感染者S區“a”蛋白決定簇基因測序結果見圖2。8例隱匿性HBV感染者“a”決定簇內推導蛋白序列結果見圖3。“a”決定簇外基因突變位點如圖4所示。由圖2－4可知，S基因的擴增區為nt203－nt767，共564 bp，包括a決定簇(124－147殘基)的基因，第122，160位氨基酸分別為賴氨酸和精氨酸，為adr亞型。a決定簇內基因序列比對發現，nt587出現G→A的突變，推導氨基酸由甘氨酸變異為精氨酸，即較為常見的G145R突變。a決定簇外基因序列比對發現，nt355、nt484堿基均由A→C，推導氨基酸無變化，nt512堿基由C→A，推導氨基酸由脯氨酸變異為蘇氨酸。

圖2 8例隱匿性HBV感染患者S區“a”蛋白決定簇基因測序結果

圖3 8例隱匿性HBV感染者“a”決定簇內推導蛋白序列結果

圖4 “a”決定簇外基因突變位點

3 討論

目前在臨床上約10%－20%的慢性肝病患者依據臨床表現和常規生化及血清學檢查仍不能明確病因，其中包括20%肝癌，15%肝硬化［1］。在部分血清HBsAg陰性的個體，應用PCR技術可以檢測出血清和肝組織中HBV DNA陽性，稱之為隱匿性HBV感染。這種感染可發生于抗HBs和/或抗HBc陽性的患者，也可見于血清 HBVM均陰性的個體［2］。隱匿性HBV感染的機制尚不完全清楚，目前研究認為，HBV低水平復制、抗原表達量低、HBV基因變異、HBV整合到宿主染色體中、外周血單核細胞系感染、宿主免疫應答異常等均可導致隱匿性HBV感染［3，4］。目前關注較多的是病毒基因變異，因病毒基因變異可導致檢測結果出現假陰性，亦可導致病毒低水平復制，抗原表達量低，低于檢測限或導致病毒顆粒分泌障礙［5］。Nakamoto等［6］對 2 例確診為非乙非丙型肝炎患者中檢測出低水平的HBV，在隨訪中，用PCR方法擴增出S或X基因，通過測序，發現HBV存在變異，其中1例DR2的5'端發生T→C的突變，另1例還同時存在X區的155 bp缺失。這些病毒分子發生的變異可從不同角度解釋發生隱匿性HBV感染的原因。

本實驗對8例隱匿性HBV感染者，通過擴增nt56－nt767 HBV S區DNA片段并基因測序，分析可能影響隱匿性HBV感染的分子生物學機制。由于隱匿性HBV感染病毒極低水平復制，病毒載量較低，故采用靈敏度較高的巢式PCR方法。在引物選擇上，選擇較為保守的S區。S區的變異影響了HBsAg的檢出和病毒大顆粒的裝載及釋放，也會導致病毒的低水平復制。所以，本次測序選擇S區，查找變異位點，分析與隱匿性HBV感染的關系。

HBsAg共有9個亞型，擁有一個共同保守的a決定簇，其主要由S區的124－147aa(氨基酸)構成。在空間結構上，由aa124與aa137和aa139與aa147的半胱氨酸經雙硫鍵連接成兩個袢狀結構，此結構對a決定簇的功能起重要作用。一般認為a決定簇的145位氨基酸突變率發生最高，其次為126、141、122或者123也常發生突變。本組76例不明原因肝病患者中有16例為血清HBV DNA陽性者，陽性率21%。隨機選擇8例測序，a決定簇內nt587出現G→A的突變，推導氨基酸由甘氨酸變異為精氨酸，即較為常見的G145R突變。a決定簇外基因序列比對發現，nt355、nt484堿基均由A→C，推導氨基酸無變化，nt512堿基由C→A，推導氨基酸由脯氨酸變異為蘇氨酸。

綜上所述，HBV感染人體是一個復雜的生物學過程，尤其是HBVM全陰性的隱匿性感染，其發生機制復雜，涉及HBV的變異、整合、隱蔽及宿主的免疫缺陷等。本研究發現，G145R突變在隱匿性HBV感染中發生，可導致S基因區變異，這可能是導致HBV隱匿性感染的重要原因之一，有待深入研究。

［1］ Hollinger FB，Sood G.Occult hepatitis B virus infection:a covert operation［J］.J Viral Hepat，2010，17(1):1－15.

［2］ Formijn J，Hans L，Ben B.Occult hepatitis B infection:an evolutionary scenario［J］.Virol J，2008，5(12):146－148.

［3］ Aller de la Fuente R，Gutiérrez ML，Garcia-Samaniego J，et al.Pathogenesis of occult chronic hepatitis B virus infection［J］.World J Gastroenterol，2011，17(12):1543－1548.

［4］ 陳常云，朱新宇.隱匿性乙型肝炎病毒(HBV)感染［J］.中華肝臟病雜志，2005，13(11):873－875.

［5］ Raimondo G，Pollicino T，Cacciola I，et al.Occult hepatitis B virus infection［J］.J Hepatol，2007，46:160－170.

［6］ Nakamoto N，Saito H，Edinuma H，et al.Genomic mutations with amino acid substitutions of circulating hepatitis B virus found in non B，non C patients with hepatocellular carcinoma［J］.Inter Med，2003，42(4):322－330.