肺炎嗜衣原體Pmp21蛋白原核表達載體的構建

劉良專 游曉星 徐磊 吳移謀

肺炎嗜衣原體Pmp21蛋白原核表達載體的構建

劉良專 游曉星 徐磊 吳移謀

目的 PCR擴增肺炎嗜衣原體多形態膜蛋白Pmp21基因，構建pGEX-6p-2／Pmp21原核表達載體。方法 篩選Pmp21優勢抗原表位，PCR法擴增Pmp21目的基因；并亞克隆至pGEX6p-2原核表達載體；經PCR與測序鑒定。結果 軟件分析選擇Pmp21優勢抗原表位編碼基因的154bp～885bp位堿基序列，設計引物PCR法擴增得到目的片段；構建重組質粒經測序鑒定， BLAST比對與Genbank上登錄序列完全一致。結論 成功構建pGEX-6p-2／Pmp21載體，為研究Pmp21在Cpn感染中的作用奠定基礎。

肺炎嗜衣原體；Pmp21；載體

肺炎嗜衣原體多形態膜蛋白（polymorphic membrane proteins,Pmp）的發現是衣原體全基因序列分析的重大成果[1]。發現Cpn有21個基因編碼Pmp1～Pmp21[2-4]，其中PmpD (Pmp21)引起了人們的廣泛重視[5]。為此，本研究克隆Pmp21優勢抗原表位，為探討其在Cpn感染中的應用奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體 Cpn AR39株、pGEX-6p-2載體南華大學病原生物學研究所保存。

1.1.2 主要試劑與試驗動物 限制性內切酶、DNA 聚合酶均為MBI產品、 DNA標準、蛋白質標準MBI公司。

1.2 方法

1.2.1 Pmp6和Pmp21基因序列的獲取 登陸互聯網登陸（http://stdgen.northwestern.edu/），獲取Pmp21堿基序列，其Gene ID為Cpn0963。

1.2.2 Pmp21蛋白優勢抗原表位的預測 登陸互聯網登陸http://www.expasy.org/tools/protscale.html,輸入Pmp21的核苷酸序列，篩選Pmp21優勢抗原表位。

1.2.3 原核表達載體pGEX-6p-2/ Pmp21的構建與鑒定 prime 5設計 PCR引物， P1 序列為 5’-CGC GGATCC TCTGCTCATGTTGAAGAGGC -3’， P2序列為5’- TTTTCCTTTT GCGGCCGC CACAATGGGTCACAACAATG-3’，引入 BamHI和 NotI 酶切位點及保護性堿基。PCR反應條件為：95℃ 3min預變性，95℃45s， 53℃ 30s，72℃2.5min，循環28次，72℃延伸8min 終止反應， 產物經 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析，純化后克隆到pGEX-6p-2上，并轉化入E.coli BL21中，經PCR篩選和測序（上海生工公司)鑒定。

2 結果

2.1 Pmp6、Pmp21優勢抗原表位預測結果

經Expasy軟件分析Pmp21基因的抗原表位結果顯示，其整個分子抗原性均較強，存在多個強抗原表位，其親水性和可及性參數結果如圖1、圖2。

圖1 親水性分析

圖2 可及性分析

2.2 Pmp21編碼基因的PCR擴增

以重組質粒及Cpn AR-39株全基因組DNA為模板，PCR分別擴增Pmp21基因片段，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示擴增出特異性目的基因與預期片段大小一致（圖3）。

圖3 PCR擴增Pmp6、Pmp21PCR產物1.5%瓊脂糖電泳分析(1) 陰性對照； (2)陽性對照(756bp）； (3)DNA marker；(4) Pmp21 PCR 產物 (732bp）； (5)PCR鑒定產物

2.3 基因測序結果與Blast分析

將原核表達載體進行測序鑒定，并用Blast軟件對測序結果與GenBank上登陸的目的序列進行比較分析，表明擴增的目的基因序列與GenBank公布的基因序列相同，且密碼子讀碼框無移位。

3 討論

本實驗表明選用的Pmp蛋白有較強的免疫反應性和抗原性，且軟件分析存在多個抗原優勢表位；我們選取的基因片段高度保守，并與其他已知基因同源性低，在以后的實驗中可以避免抗原之間的交叉反應，從而有利于提高實驗方法的特異性和靈敏性；目前國內外尚無這種蛋白在Cpn感染中的應用研究報道[6]。為此，本研究克隆Pmp21優勢抗原表位，為探討其在Cpn 感染中的應用奠定實驗基礎。

本研究中所使用的克隆和表達載體pGEX-6P-2，其多克隆酶切位點含有BamHI/NotI，檢索發現在本研究預測基因的完整序列中沒有該酶切位點，從而選用該組限制性內切酶作為該基因克隆的工具酶。此外，由于使用該載體進行轉化表達后的蛋白為GST融合蛋白，這為進一步分離純化目的蛋白提供了依據。我們依據基因庫提供的基因序列設計引物，且選擇了雙酶切方法，能使目的基因定向插入到pGEX-6P-2載體上。并使用不同的方法對重組體進行鑒定：起初通過PCR方法對轉化后在選擇培養基上生長的細菌克隆進行初步篩選，篩選到陽性克隆。再對篩選陽性克隆進一步培養后進行測序鑒定，并與基因庫提供的基因序列進行比對，最后進一步證實克隆到載體中目的基因序列的正確性，為該蛋白的后續研究奠定了基礎。

[1] Tanzer RJ, Longbottom D, Hatch TP, et al. Identification of polymorphic membrane proteins of Chlamydia psittaci 6BC[J]. Infect Immun, 2001,69(4):2428-2434.

[2] Grimwood J,Stephens RS. Computational analysis of the polymorphic membrane protein superfamily of Chlamydia trachomatis and Chlamydia pneumoniae[J]. Microb Comp Genomics ,1999,4(3):187-201.

[3] Campbell LA, Kuo CC, Grayston JT. Structural and antigenic analysis of Chlamydia pneumoniae[J]. Infect Immun,1990 , 58(1): 93-97.

[4] Vandahl BB, Pedersen AS, Gevaert K, et al. The expression, processing and localization of polymorphic membrane proteins in Chlamydia pneumoniae strain CWL029[J]. BMC Microbiol,2002,36(9):1-12.

[5] Maria SC, Luca B, Maurizio C，et al. Identification of immunoreactive proteins of Chlamydia trachomatis by western blot analysis of a two-dimensional electrophoresis map with patient sera[J]. Electrophoresis，1999,20(11):2269-2279.

[6] Sharma J, Zhong Y, Dong F, et al. Profiling of human antibody responses to Chlamydia trachomatis urogenital tract infection using microplates arrayed with 156 chlamydial fusion proteins[J]. Infect Immun, 2006,74(3):1490-1409.

10.3969/j.issn.1009-4393.2011.36.026

國家自然科學基金資助(No. 30870134/ c010902)

421001 南華大學病原生物研究所 （劉良專 游曉星 徐磊吳移謀）

吳移謀 E-mail:yimouwu@sina.com.cn