高粱 DNA 導入引起小麥 HMW-GS的 變異及其品質改良和變異機理分析

歐巧明 倪建福 崔文娟 龐斌雙

(甘肅省農業科學院生物技術研究所1,蘭州 730070)

(北京市農林科學院雜交小麥工程技術研究中心2,北京 100089)

高粱 DNA 導入引起小麥 HMW-GS的 變異及其品質改良和變異機理分析

歐巧明1倪建福1崔文娟1龐斌雙2

(甘肅省農業科學院生物技術研究所1,蘭州 730070)

(北京市農林科學院雜交小麥工程技術研究中心2,北京 100089)

采用花粉管通道法,將高粱 (Sorghum bicolor L.)基因組 DNA導入粉質籽粒的穩定品系 89122中,后代經多代連續選擇優良變異系,并進行了高分子質量麥谷蛋白亞基的 SDS-PAGE電泳檢測和品質化驗分析。獲得 1個穩定遺傳變異新品種,與導入受體 89122相比,后代新品系 2001502-23含有 7+8、5+10優質亞基,HMW-GS發生明顯變異,GulD1位點基因發生等位變異,其表達產物由原來 (89122)的 2+12亞基為 5+10亞基;其品質指標較受體得到改善,從而實現了受體小麥 HMW-GS基因的遺傳轉化和品質改良。說明利用花粉管通道法完全可以實現小麥 HMW-GS基因的轉化和品質目標性狀的遺傳改良。而生物誘變是其可能的遺傳轉化和變異機理之一。

小麥 高粱 DNA 花粉管通道法 高分子質量谷蛋白亞基 (HMW-GS) 等位變異

國內小麥品種麥谷蛋白亞基是改善烘烤品質的限制因子,其中 Glu-D1位點的品質效應來源于 5+10亞基與 2+12亞基之間的差異,5+10亞基取代 2+12亞基將可能改善小麥的烘烤品質[1-3]。近年來,小麥品質的遺傳改良愈加被重視。有計劃的常規/遠緣雜交和系統選育等作為主要手段在小麥品種改良中發揮了重要作用,但這也使得小麥的遺傳基因資源愈加狹窄,其品質改良也受到很大限制[4]?；ǚ酃芡ǖ婪ń閷У倪z傳轉化等分子育種技術為小麥品質改良提供了新的途徑。

已有的研究結果表明,花粉管通道法介導的遺傳轉化及其后代能產生變異,已相繼在 40多種作物上取得了顯著成效[5-6];在國外 SCI/EI期刊也相繼出現報道[6-10],并已獲得大量優良小麥[11-14]新品種。利用花粉管通道法將多種異源基因組 DNA導入春小麥,成功實現了小麥的遺傳改良[4,12,15-16]。其中將高粱基因組 DNA導入受體甘麥 8號,經高分子質量麥谷蛋白亞基 (HMW-GS)SDS-PAGE電泳檢測,后代 89144的 HMW-GS發生了突變,由受體的2+12亞基變為 5+10亞基,其他幾個轉基因后代與其受體相比,HMW-GS雖未發生變化,但各亞基的相對質量分數有較大變化,實現了小麥 HMW-GS基因的轉化和品質性狀的遺傳改良[4]?？梢?在普通小麥優良谷蛋白基因缺乏的情況下,采用花粉管通道法、分子標記等分子育種技術進行小麥品質改良是完全可行的。

本研究擬采用花粉管通道法,將高粱 (Sorghum bicolorL.)基因組 DNA導入粉質籽粒的穩定品系89122,對其品質進行改良,并對其后代進行 HMWGS檢測和品質化驗分析,以期引入普通小麥缺乏的優良品質性狀基因,在品質育種方面更加突出目標性狀的遺傳改良,創造特異新種質和優良新品種,也為外源DNA導入創造優良新品種等相關研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試材料

外源 DNA供體:高粱 6A/115(Sorghum bicolor L.),禾本科高粱屬,一年生草本,體細胞染色體數目2n=20,生育期 130 d,分蘗旺盛,抗逆性強,適應性廣[17]。由甘肅省農科院生物技術研究所引種。

受體材料:89122,甘肅省春小麥品種,2n=42,籽粒粉質,耐鹽堿,高感條銹病,品質較差。由甘肅省農科院生物技術研究所采用花粉管通道法育成的粉質春小麥品種[18]。

1.1.2 儀器

Ther mo Helios可見 /紫外分光光度計:UN I CAM公司;PROTEAN II xi電泳儀 (Biorad Mini-Protean Tetra Electrophoresis System):美國 Bio-rad公司;FTI-500型 Fujifilm凝膠成像系統:Pharmacia公司;Te2 cator1030全自動凱氏定氮儀:瑞典 Tecator公司;GX2 DL-202型蛋白質 -賴氨酸分析儀:北京檢測儀器廠;HGT-1000型容重器:上東方衡器廠;BAU-A型沉淀值測定儀:中國農業大學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 供體總 DNA的提取

采用 CTAB法,按照劉學春等[19]報道的方法,提取供體高粱基因組 DNA,紫外分光光度計檢測,A260/A230=2.13>2.00,A260/A280=1.87>1.80;瓊脂糖電泳呈單一區帶,無拖尾現象,表明所提純的 DNA分子質量在 50 ku以上,蛋白質等雜質已去除干凈,達到作物DNA導入所要求的純度?；蚪M DNA溶于1×SSC溶液,4℃儲存,導入前用蒸餾水稀釋至300μg·mL-1。

1.2.2 供體高粱基因組 DNA的導入及后代的處理與選擇

供體高粱基因組 DNA的花粉管通道法導入參考倪建福等的方法[4,18]。待導入穗幼胚形成后,記作D0代種子。取其 15～20 d胚齡的幼胚進行幼胚培養,于MS培養基上直接誘導幼胚成苗 (D1),并于溫室加代選擇,所獲 D1代種子進行田間點播。D2代點播于單株選擇圃,選擇各種變異株,按單株收取種子;自 D3代起播種于株系選擇圃,連續選擇優良株系,直至獲得穩定的變異株系和有價值的育種材料。D4～D6代依次參加高代產量比較試驗、品系鑒定試驗和品種比較試驗,逐代篩選優良品系。自 D1代起進行觀察、記載和統計分析。

1.2.3 高分子質量麥谷蛋白亞基鑒定

參考倪建福等的方法[4]。HMW-GS樣品的制備過程:單粒種子放入玻璃紙中磨碎后轉進 1.5 mL離心管中,加入 150μL提取液 (100 mL中含 12.5 mL,0.5 mmol/L的 TrisHCl,pH 6.7,20 mL,10%的SDS,5 mL巰基乙醇,10 mL甘油,10 mL,0.02%的溴酚藍),玻棒碾磨 3～5 min,沸水中煮 3 min,6 000～7 000 r/min離心 10 min,取上清液加 125μL,70%乙醇沉淀麥谷蛋白,10 000 r/min再離心5 min,收集沉淀。沉淀涼干后用 50μL提取液溶解待用。

SDS-PAGE:采用 SDS連續緩沖系統,分離膠10%(pH 8.9),濃縮膠 3.5%(pH 6.7)。SDSPAGE電泳:電極緩沖液為 0.025 mmol/L TrisCl,0.192 mmol/L甘氨酸,0.001%SDS,pH 8.3。濃縮膠電壓為 200 V,進入分離膠后 100 V穩壓電泳。染色、脫色和保存:凝膠用 10%三氯乙酸固定后,0.05%,R-250染色 3 h,7.0%冰乙酸溶液脫色至背景清晰。照相、掃描或干膠保存。

1.2.4 品質分析

自D6代委托省級作物品質化驗分析機構 (甘肅省農業科學院農業測試中心)進行新品系的品質化驗分析。容重測定:采用稱重法 (GB/T5498—1985);粗蛋白含量測定:采用半微量凱氏定氮法(GB5511—1985);氨基酸含量測定:采用染料結合法(GB4801—1984);沉淀值測定:采用 SDS法 (GB/T15685—1995);濕面筋測定:采用手工洗滌法 (GB/T14608—1993);淀粉含量測定:采用采用α-淀粉酶法 (GB/T 9826—1988)。

2 結果與分析

2.1 高分子質量麥谷蛋白亞基鑒定

HMW-GS檢測結果顯示:后代新品系 2001502-23含有 7+8、5+10優質亞基,與導入受體 89122(含有 7+8、2+12亞基 )相比 ,HMW-GS發生明顯變異,GulD1位基因發生等位變異,其表達產物由原來 (89122)的 2+12亞基為 5+10亞基,但高粱種子貯藏蛋白中并沒有亞基 5+10,從而實現了麥谷蛋白亞基的改良。這與倪建福等[4]報道的高粱基因組DNA的導入春小麥甘麥 8號的后代 89144的 HMWGS基因變異情況相同。這種相同的異源供體基因組DNA導入不同小麥材料產生了相同的變異情況,其可能的原因是異源高粱基因組DNA的導入對受體基因組中 HMW-GS基因的生物誘變機理和效果相同所致。

圖 1 外源DNA導入受體與后代新品系的 HMW-GS組成的比較

2.2 籽粒和面粉品質分析

外源DNA供體、導入受體與后代新品系的籽粒營養及加工品質分析結果顯示,外源 DNA導入新品系 2001502-23的容重、蛋白質含量、籽粒粗蛋白含量、賴氨酸質量分數、濕面筋質量分數、沉淀值等較導入受體 89122和DNA供體高粱均出現不同程度的明顯增加 (見表 1)。排除高粱作為雜糧作物本身的品質指標較低外,導入新品系 2001502-23其較導入受體 89122的粗蛋白質量分數提高 17.56%,容重提高3.80%,賴氨酸質量分數提高 9.11%,濕面筋質量分數降低10.30%,沉淀值降低 11.38%,品質類型均屬于中筋小麥,導入新品系籽粒綜合品質得到明顯改善。將高粱DNA導入受體小麥隴春 13就可獲得了品質指標得到改良的小麥品系 89122[18]。我國首批面包小麥品種蛋白質質量分數為 14.64%～18.61%[20-21],而小麥淀粉特性是決定含小麥淀粉食品食用品質的一個主要因素[22],沉淀值可作為小麥品種選育過程中預測面條筋力的首選指標[23-25]。這些研究結果證明高粱外源基因導入小麥引起了相應基因表達和蛋白質等籽粒和小麥粉品質性狀的變化。

表 1 外源DNA供體、導入受體與后代新品系的籽粒營養及加工品質的比較與分析

3 討論與結論

利用花粉管通道法將多種異源基因組 DNA導入小麥,實現小麥的品質、抗性等多方面的遺傳改良已成為小麥生物技術育種的重要手段之一。

將高粱基因組 DNA導入粉質籽粒的穩定小麥品系,獲得 1個穩定的遺傳變異優良新品種,實現了受體小麥 HMW-GS基因的遺傳轉化和品質性狀改良,與王廣金等[26]、倪建福等[4]、劉香利等[27]報道的結果相同,這說明 HMW-GS基因的轉化和遺傳變異具有相當的共性,加之目前 HMW-GS基因定位較清楚,有望成為品質遺傳改良中的標記基因。

本研究中,異源高粱基因組 DNA導入受體小麥后,后代新品系 HMW-GS發生明顯變異,Gul D1位點基因發生等位變異,其表達產物由原來 (89122)的2+12亞基為 5+10亞基,但高粱種子貯藏蛋白中并沒有亞基 5+10。該結果與倪建福等[4]報道的高粱基因組DNA的導入春小麥甘麥 8號的后代 89144的HMW-GS基因變異情況相同。這種相同的異源供體基因組 DNA導入不同小麥材料產生了相同的變異情況,其可能的原因是異源高粱基因組 DNA的導入對受體基因組中 HMW-GS基因的生物誘變機理和變異效果相同所致。外源基因進入受體后會受到包括選擇在內的各種因素的影響,且涉及到結構基因和調控基因相互作用以及插入片段的位置效應等。張魯軍等[28]報道了 HMW-GS基因可能發生的基因沉默、相關元件的激活等,包括染色體部分缺失、調控元件突變以及基因突變等。李三和等[29]報道,在外源基因的影響下,雜交后代出現了新的、雜交親本并不表達的高分子質量麥谷蛋白亞基,并認為這是多拷貝的外源基因在不同于受體環境的細胞質中的表達發生了變化,且由于外源基因的插入引起了內源高分子質量麥谷蛋白亞基組成的變異。上述研究中異源高粱基因組 DNA導入受體小麥后的新品系高分子質量麥谷蛋白亞基的變異機理也可能與此情況類似。

另外,關于外源 DNA導入引起變異的機理,提出了各種推測:①外源DNA重組插入具有調節基因功能的高度或中度重復序列,從而改變其調節功能,也不排斥外源 DNA重組插入導致單一序列的結構基因失活或突變[30]。②外源 DNA導入前期或整合時存在被受體切割酶與重組酶適當酶切和重組的過程,從而導致導入后代產生廣泛變異[31]。③外源DNA與受體細胞中的組蛋白及非組蛋白結合形成“小染色體”(從而不被酶降解),與受體染色體局部同源,可與受體染色體局部形成“擬聯會復合體”,在受體DNA復制時,擬聯會復合體中外源DNA和與受體同源DNA片段發生置換;而不同源的小染色體可能以“B-染色體”形式存在或被消化。④個別較小的外源DNA斷片有可能在受體 DNA復制時直接插入其中[32]。

外源DNA導入后代性狀變異是供體與受體基于DNA分子局部親和性而產生片段雜交的必然結果。萬文舉等[33]報道外源 DNA導入的雙重作用:直接轉化和生物誘變。因此,直接遺傳轉化和生物誘變均是外源 DNA導入可能的遺傳轉化機理之一,是一種綜合作用的結果。這也表明花粉管通道法會引起很復雜的受體遺傳特性的變化。而本研究在不同時間階段和不同受體材料下的研究結果出現如此相似的結果,這可能是異源高粱基因組 DNA導入小麥后受體基因組發生的相同作用和類似變異的普遍現象。關于高粱DNA導入引起小麥 HMW-GS基因突變的確切分子機理目前正在進行當中,將另文報道。

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Introducing Sorghum DNA into SpringWheat:HMW-GS Variation,Quality I mprovement and ItsMechanis ms

Ou Qiaoming1Ni Jianfu1CuiWenjuan1Pang Binshuang2
(Bio-technology Institute,Gansu Academy ofAgricultural Sciences1,Lanzhou 730070)
(HybridWheat Engineering And Technique Research Center,Beijing academy of agriculture and forestry sciences2,Beijing 100089)

The genome DNA of sorghum was introduced into floury grain springwheatNo.89122 via the pollen tube pathway.Excellent variant lineswere chosen with multi-generation selecting.The detection of HMW-GS by SDS-PAGE electrophoresis and quality analysiswere conducted.One stable variantwasobtained.Comparedwith its recipientNo.89122,the new variant 2001502-23 contained quality subunits 7+8 and 5+10,significant variation of HMW-GS occurred,gene alleles appeared in Gul D1Locus,and HMW-GS 5+10 were expressed in variants 2001502-23 while subunits 2+12 were presented in its recipient No.89122. Its quality indexes were i mproved compared with the receptor.Thus the genetic transformation of HMW-GS gene and quality improvement for the re2 ceptorwheatwas realized in this study.This result indicates that the genetic transfor mation of HMW-GS gene and ai m character i mprovement of quality in wheat can be entirely achieved via the pollen tube pathway.In addition,the bio-inducted mutation is one of the mechanisms of its genetic transfor mation.

wheat,sorghum DNA,pollen-tube pathway,HMW-GS,gene alleles

S512.332

A

1003-0174(2011)01-0015-05

甘肅省重大科技專項(0801NKDA015),甘肅省科技支撐計劃[自然科學基金 ](0803RJZA041),甘肅省農科院農業科技創新專項(2009GAAS16)

2010-03-22

歐巧明,男,1976年出生,助理研究員,碩士,小麥生物技術育種及品質改良

倪建福,男,1951年出生,研究員,小麥生物技術育種