蕨根淀粉的組分分離和純化研究

孟凡冰 陳 戀 鐘 耕,2 吳應梅,3

(西南大學食品科學學院1,重慶 400716)

(重慶市特色食品工程技術研究中心2,重慶 400716)

(重慶三峽學院生物系3,重慶 404000)

蕨根淀粉的組分分離和純化研究

孟凡冰1陳 戀1鐘 耕1,2吳應梅1,3

(西南大學食品科學學院1,重慶 400716)

(重慶市特色食品工程技術研究中心2,重慶 400716)

(重慶三峽學院生物系3,重慶 404000)

以蕨根淀粉為原料,采用有機溶劑低溫重結晶法和凝膠色譜分析對蕨根淀粉的分級和純化進行了研究。結果表明:用正丁醇重結晶法重結晶 8次和 5次,可以得到高純度的蕨根直鏈和支鏈淀粉。蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉與碘絡合物的最大吸收波長分別為 640 nm和 547 nm,直鏈淀粉和支鏈淀粉的藍值分別為0.91和 0.13,均處于相應的分布范圍,表明純化后蕨根直鏈和支鏈淀粉的純度高。蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的分子質量范圍均小于玉米直鏈淀粉和支鏈淀粉。采用分光光度法測定蕨根淀粉含直鏈淀粉為 25.38%,高于玉米淀粉的 20.33%。

蕨根淀粉 分級 純化 研究

天然可再生的淀粉是一種混合物。它是由兩種不同糖苷鍵連接而成的淀粉組成,一種是直鏈淀粉,另一種是支鏈淀粉[1]。直鏈淀粉是一種相對分子質量較小的鏈狀分子,而支鏈淀粉是一種相對分子質量較大、高度分枝的大分子[2]。直鏈淀粉由于分子排列比較整齊,分子容易相互靠攏重新排列,所以在冷的水溶液中,直鏈淀粉有很強的凝聚沉淀性能。支鏈淀粉的分子大,各支鏈的空間阻礙作用使分子間的作用力減小,而且由于支鏈的作用,使水分子容易進入支鏈淀粉的微晶束內,阻礙了支鏈淀粉分子的凝聚,使支鏈淀粉不易凝沉[3],工業上常利用這一特性將直鏈淀粉和支鏈淀粉分開。淀粉的級分組成、分子結構、相對分子質量分布等對其凝膠特性、流變特性、熱特性和形貌有較大影響,從而影響到淀粉食品的深加工[4]。蕨根淀粉為天然的野生植物淀粉,研究證明蕨根淀粉制品具有強身健體、防癌抗癌之功效,開發前景十分廣闊[5-6]。我國蕨根資源豐富,開發利用蕨根淀粉資源,將其應用于食品與保健食品中,具有重要的社會意義和經濟價值[7]。關于蕨根淀粉的分離純化、分子結構的基礎研究尚未見報道。本試驗以蕨根淀粉為原料,分離純化蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉,并預測其相對分子質量范圍,為從分子水平了解蕨根淀粉的物化特性提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與化學試劑

蕨根 (Athyeium.breuifrons)淀粉,自制[6],經測定淀粉純度為 98.7%,水分質量分數為10.29%;玉米淀粉,華北制藥康欣有限公司。

Sepharose CL-2B:瑞典 Phar macia公司,其余試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器

FA2004A電子天平:上海精天電子儀器有限公司;TGL-16G型離心機:上海安亭科學儀器廠;S53-54型紫外可見分光光度計:上海棱光技術有限公司;HH-4型恒溫水浴鍋:金壇市富華儀器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱:上海精宏試驗設備有限公司;漩渦混合器:上海青滬儀器廠;79-1磁力攪拌器:上海金城國勝實驗儀器廠;BS2-160自動部分收集器:上海精科實業有限公司;210型酸度離子儀:北京哈納科儀科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 直鏈淀粉與支鏈淀粉的分離純化

1.3.1.1 直鏈淀粉與支鏈淀粉的粗分離

稱取 10.0 g淀粉,放入 500 mL燒杯中,加蒸餾水 50 mL使淀粉分散,再加 0.5 mol/L NaOH溶液300 mL。在沸水浴中加熱 20～30 min至整個淀粉糊完全透明,冷至室溫,離心 (4000 r/min,20 min)除去未分散的不溶性雜質 (沉淀部分)。以 2 mol/L HCL中和離心液至 pH為 6.5～7.5,再加 100 mL正丁醇-異戊醇 (3∶1)混合溶液,然后在沸水浴中加熱攪拌10 min至整個體系透明,冷卻至室溫。移入 2～4℃冰箱中靜置 24 h,離心 (6 000 r/min,20 min),沉淀物為粗直鏈淀粉,上清液即為粗支鏈淀粉[8-9]。分別收集備用。

1.3.1.2 直鏈淀粉的純化

將沉淀物即粗直鏈淀粉全部移入裝有 100 mL 90%的二甲基亞砜溶液中,再加入 200 mL飽和的正丁醇水溶液,然后在沸水浴中加熱攪拌至溶液分散透明,冷至室溫,在 2～4℃冰箱中保持 24 h,取出離心 (6 000 r/min,30 min),所得的沉淀物按上述步驟重復操作 8次 (即重結晶 8次),然后將沉淀物浸于無水乙醇中 24 h,再反復以無水乙醇洗滌沉淀,該沉淀物于室溫下真空干燥,得到純化的直鏈淀粉樣品,經稱量為 1.4 g(干基,下同)。無水乙醇洗滌沉淀的目的是除去直鏈淀粉中所絡合的正丁醇。

1.3.1.3 支鏈淀粉的純化

將 1.3.1.1中的粗支鏈淀粉上清液置于分液漏斗中靜置,取下層液加 40 mL正丁醇 -異戊醇 (3∶1)混合液,在沸水浴中加熱攪拌至溶液分散透明,冷至室溫,移入 2～4℃冰箱中靜置 24 h,離心 (6 000 r/min,30 min)去除沉淀物,用上清液重復上述操作 5次 (即重結晶 5次)。上清液加入 2倍體積的無水乙醇沉淀,離心,將沉淀溶于熱的 200 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中,離心去沉淀,中和。離心液中再加 2倍體積的無水乙醇,將沉淀溶于 200 mL蒸餾水中,用 2倍體積的無水乙醇再沉淀,以無水乙醇洗滌數次,室溫下真空干燥得到純化的支鏈淀粉樣品,經稱量為 5.7 g。

1.3.2 凝膠過濾層析

1.3.2.1 淀粉樣品溶液的制備

分別稱取天然淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉樣品 50 mg,用 1 mL無水乙醇濕潤,加入 2 mL 2 mol/L NaOH溶液和 5 mL蒸餾水,在沸水浴中加熱 20 min,使樣品完全溶解后,在 4℃的冰箱中放置 12 h。用1 mol/L的鹽酸中和至 pH 7.0左右,最后加蒸餾水將溶液定容至25 mL,此淀粉溶液的濃度為 2 mg/mL[10]。

1.3.2.2 層析條件

選用 Sepharose CL 2B層析柱 (Φ1.3×70 cm),取上述樣品溶液 1mL進樣,以 0.05 mol/L NaCL(含0.02%疊氮鈉)溶液洗脫,洗脫速率 9 mL/h。用自動部分收集器收集洗脫液,每管收集 3 mL,取 1 mL收集液用苯酚 -硫酸比色法 (1 mL 6%苯酚和 5 mL濃硫酸),在 490 nm測定吸光度[11]。

1.3.3 純化蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉碘復合物光譜掃描

準確稱取 5 mg樣品,加 0.1 mL無水乙醇浸潤,再加 0.5 mL 2 mol/L NaOH,充分振蕩,室溫下放置12 h后,用 HC1將此溶液調至 pH 7.0左右,加水使其體積為 5 mL。此溶液的濃度為 1 mg/mL。取 1 mL淀粉溶液,加 35 mL蒸餾水,用 0.05 mol/L HC1調節至 pH 3.0,加入 0.5 mL碘試劑 (3.6 g碘化鉀于20 mL蒸餾水中,加 1.3 g碘,溶解后定容至 100 mL),定容至 50 mL,充分混勻后用 S53-54紫外可見分光光度計于波長 400～800 nm對樣品進行吸收光譜掃描測定[12]。

1.3.4 藍值

稱取直鏈和支鏈淀粉各 1 mg,用 10 mL蒸餾水溶解,加入 2 mg碘和 20 mg碘化鉀,定容至 100 mL,在 680 nm處測定其吸光度。藍值是表示淀粉結合碘能力的另一個指標,通過測定所形成絡合物在一定波長下的光吸收值,按下式計算而得[13]。

1.3.5 直鏈淀粉含量測定

1.3.5.1 標注曲線的繪制

準確稱取 0.100 0 g自制的蕨根標準直鏈淀粉和支鏈淀粉,置于 100 mL燒杯中,用 1 mL無水乙醇濕潤,加入 1 mol/L氫氧化鈉溶液 9 mL,在沸水浴加熱至完全分散,迅速冷卻后定容至 100 mL;將直鏈淀粉和支鏈淀粉分散液及 0.09 mol/L氫氧化鈉溶液以一定比例混合;在混合溶液中加入乙酸溶液和碘試劑,顯色 10 min后,在 620 nm處測定其吸光度;以吸光度為縱坐標,直鏈淀粉含量為橫坐標,繪制標準曲線得出回歸方程。

1.3.5.2 樣品測定

準確稱取 0.100 0 g淀粉樣品,置于 100 mL燒杯中,用 1 mL無水乙醇濕潤,加入 1 mol/L氫氧化鈉溶液 9 mL,在沸水浴加熱至完全分散,迅速冷卻后定容至 100 mL;準確吸取 2.5 mL淀粉分散液于 50 mL容量瓶中,加入 0.5 mL 1 mol/L乙酸溶液和 1 mL碘試劑,用漩渦混合器充分混合,加水定容至 100 mL,顯色 10 min后,在 620 nm處測定其吸光度[14]。

2 結果與討論

2.1 影響直鏈淀粉和支鏈淀粉分離及純度的主要因素

影響直鏈淀粉和支鏈淀粉分離及純度的主要因素包括用堿液分散淀粉時的攪拌速度、直鏈淀粉從鹽溶液中分離出來的速度、純化時正丁醇和水的用量、離心力的大小等。用堿液分散淀粉時的攪拌速度是影響分離效果的主要因素,如果攪拌劇烈,會使整個膠體結構破壞,導致直鏈淀粉與支鏈淀粉無法完全分離,所以應用小玻璃棒輕輕攪動最好。直鏈淀粉在鹽溶液中容易老化,一旦老化,分離的直鏈淀粉即使加熱也極難溶解,在多次重結晶的過程中,增大水的用量使直鏈淀粉的濃度下降,可延緩直鏈淀粉的老化。離心力的大小和離心的溫度也是影響淀粉分離及純度的主要因素,當離心速度不夠或離心溫度過高時,離心液會出現混濁現象,直接影響到直鏈淀粉與支鏈淀粉的分離,因此,為了使直鏈淀粉和支鏈淀粉能夠較好的分離,離心速度必須大于 6 000 r/min,離心溫度最好控制在 2℃,離心時間最好大于20 min。

2.2 凝膠色譜分析

直鏈淀粉和支鏈淀粉不是單一的化合物,化學結構不同,性質也有差異。直鏈淀粉是葡萄糖通過α-D-1,4-糖苷鍵連接起來的直鏈狀高分子化合物,在溶液狀態下分子伸展,極性基團暴露,空間障礙小,很容易與一些極性有機化合物如正丁醇、異戊醇等通過氫鍵締合,形成結晶性化合物而沉淀。而支鏈淀粉分子除有α-D-1,4-糖苷鍵外,還存在由α-D-1,6-糖苷鍵形成的分支結構,在溶液中呈分支狀,當溶液中有極性有機化合物存在時,由于有較大的空間位阻,不易形成復合物沉淀。因此,利用這種性質可以對直鏈淀粉和支鏈淀粉進行分離。

圖 1 蕨根淀粉凝膠色譜圖

圖 2 玉米淀粉凝膠色譜圖

直鏈淀粉和支鏈淀粉的分子結構和相對分子質量,其中直鏈淀粉的相對分子質量小,一般在幾萬到幾百萬之間,支鏈淀粉的相對分子質量大,一般在幾百萬到幾億之間。當淀粉溶液通過層析柱時,分子直徑比凝膠孔大的支鏈淀粉分子不能滲透到凝膠孔內,只經過凝膠顆粒之間的空隙,隨洗脫液一起移動,先流出柱外;而分子直徑比凝膠孔小的直鏈淀粉分子,能夠進入凝膠相內,不能和洗脫液一樣向前移動,移動的速度必然要落后于支鏈淀粉分子。因此,選用 Sepharose CL-2B(分級范圍為 1×105～2×107)對淀粉進行凝膠色譜分析。蕨根淀粉和玉米淀粉的凝膠過濾色譜見圖 1和 2。由圖可知,蕨根淀粉和玉米淀粉主要有兩個級分,分別為支鏈淀粉和直鏈淀粉,其中支鏈淀粉的平均聚合度較直鏈淀粉大的多。

圖 3 蕨根支鏈淀粉和玉米支鏈淀粉凝膠色譜圖

分離純化的蕨根支鏈淀粉和玉米支鏈淀粉 (重結晶 5次)凝膠色譜見圖 3。由圖 3可知,蕨根支鏈淀粉和玉米支鏈淀粉的出峰位置都靠近外水體積,在洗脫體積為 10～50 mL之間出現單一的吸收峰,但蕨根支鏈淀粉的出峰時間要晚于玉米支鏈淀粉,說明蕨根支鏈淀粉相對分子質量要小于玉米支鏈淀粉,而玉米支鏈淀粉的相對分子質量范圍為 107～109,就是說,蕨根支鏈淀粉的相對分子質量應小于107～109。在 50 mL以后蕨根支鏈淀粉和玉米支鏈淀粉均無吸收峰出現,說明經過 5次重結晶得到的蕨根支鏈淀粉純度已經非常高了。

圖 4 蕨根直鏈淀粉和玉米直鏈淀粉凝膠色譜圖

分離純化的蕨根直鏈淀粉和玉米直鏈淀粉 (重結晶八次)凝膠色譜見圖 4。由圖 4可知,蕨根直鏈淀粉和玉米直鏈淀粉在外水體積處均無吸收峰出現,在洗脫體積為 30～70 mL之間出現單一的吸收峰。蕨根直鏈淀粉的出峰時間要晚于玉米直鏈淀粉,說明蕨根直鏈淀粉相對分子質量要小于玉米直鏈淀粉。經過 8次重結晶可以得到完全純化的蕨根直鏈淀粉。

2.3 純化蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉碘復合物吸收光譜

淀粉 -碘復合物的顏色由兩種因素決定:一是連續的螺旋直鏈淀粉片段的平均長度;二是淀粉的結晶程度。直鏈淀粉在水溶液中并不是線型分子,而是由分子內氫鍵作用使鏈卷曲成螺旋狀,每個環轉含有 6個葡萄糖殘基。當直鏈淀粉遇碘時,每個螺旋吸附 1個碘分子,碘分子位于螺旋中央,借助范德華力聯系在一起,形成深藍色絡合物。支鏈淀粉與碘根據其分支和聚合度的不同而生成紫紅 -棕紅色,淀粉 -碘絡合物吸收峰也隨之發生變化。利用淀粉結合碘后所呈現的顏色差異,可以判斷所分離淀粉的純度。直鏈淀粉與碘生成藍色,吸收峰在 600～650 nm;支鏈與碘生成紫紅色,吸收峰為 530～590 nm。蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉碘復合物在 400～800 nm范圍內的紫外可見光吸收圖譜見圖 5。從圖 5可以看出蕨根直鏈淀粉的最大吸收波長為 640 nm,支鏈淀粉與碘絡合物的最大吸收波長為 547 nm,均在相應的分布范圍內,表明純化后的蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的純度較高。

圖 5 淀粉碘復合物吸收光譜

2.4 藍值

直鏈淀粉和支鏈淀粉由于它們分子結構和線性聚合度有的差異,所以其藍值也不同,直鏈淀粉由于其線性聚合度很高,故藍值很大,一般為 0.8～1.2,支鏈淀粉的側鏈鏈長只有 14～30葡萄糖殘基,則藍值在 0.08～0.22之間。試驗測得蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的藍值為分別為 0.91和 0.14,均處于相應的分布范圍內,表明純化后的蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的純度較高。

2.5 直鏈淀粉含量測定

用自制蕨根直鏈淀粉和玉米直鏈淀粉純品作標準品,測定不同直鏈淀粉含量溶液的吸光度,得出標準直鏈淀粉標準曲線,見圖 6和圖 7。

從直鏈淀粉標準曲線看到,直鏈淀粉的含量與620 nm處的吸光度呈顯著的線性正相關。

在 620 nm處測定淀粉樣液的吸光度并計算其直鏈淀粉含量,結果見表 1。如表 1所示,蕨根淀粉的直鏈淀粉含量高于玉米淀粉,為 25.38%。

表 1 蕨根淀粉和玉米淀粉吸光度及直鏈淀粉含量

3 結論

3.1 堿液分散淀粉時的攪拌速度、直鏈淀粉從鹽溶液中分離出來的速度、純化時正丁醇和水的用量、離心速度和離心時的溫度對直鏈淀粉和支鏈淀粉的分離及純度有影響。

3.2 用正丁醇重結晶法重結晶 8次和 5次可以得到純度較高的蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉。凝膠過濾層析表明:蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的相對分子質量均小于玉米直鏈淀粉和支鏈淀粉。

3.3 從純化蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉碘復合物吸收光譜看出,蕨根直鏈淀粉與碘絡合物的最大吸收波長為 640 nm,支鏈淀粉與碘絡合物的最大吸收波長為 547 nm,均在相應的分布范圍內。

3.4 蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的藍值分別為 0.91和 0.13,均處于相應的分布范圍內,表明純化后的蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的純度較高。

3.5 蕨根淀粉和玉米淀粉的直鏈淀粉質量分數分別為 25.38%和 20.33%,蕨根淀粉的直鏈淀粉含量較玉米淀粉高。

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Fractionation and Purification of Fern Root Starch

Meng Fanbing1Chen Lian1Zhong Geng1,2Wu Yingmei1,3
(College of Food Science,Chongqing1400716)
(Engineering Technique Research Center of Chongqing for Special Food2,Chongqing 400716)
(BiologyDepartment,Chongqing Three gorgesUniversity3,Chongqing 404000)

Fern root starch was fractionated and purified by the methods of organic solvent,low temperature re2 crystallization and gel permeation.Results:Pure fern root amylose and amylopectin can be obtained,respectively after 8 times and 5 times recrystallization with n-butyl alcohol solvent.The adsorption wavelengthsλmaxof the amyloseiodine complex and the amylopectin-iodine are 640 nm and 547 nm,respectively,and their blue values are 0.91 and 0.13,respectively,all in corresponding range.It indicates that the fern root amylose and amylopectin obtained are of high-purity.The amylose contents of fern root starch and cornstarch are 25.38%and 20.33%,separately.

fern root starch,fractionation,purification,study

TS236.9

A

1003-0174(2011)01-0056-05

重慶市科技攻關項目(CSTC,2009AC5183)

2009-12-30

孟凡冰,女,1986年出生,碩士,現代食品加工理論與技術

鐘耕,男,1964年出生,教授,博士生導師,糧油食品加工、碳水化合物理論與應用研究