納濾技術用于玉米降血壓肽的脫鹽研究

杜 璟 何 慧 林閩麗 李江濤 張文君

(華中農業大學食品科技學院，武漢 430070)

納濾技術用于玉米降血壓肽的脫鹽研究

杜 璟 何 慧 林閩麗 李江濤 張文君

(華中農業大學食品科技學院，武漢 430070)

為了使經超濾分級分離的玉米降血壓肽水解液的鹽分脫除，本研究采用納濾技術對水解液進行了脫鹽處理，通過測定料液的肽截留率、鹽(Na+)截留率，經綜合比較，首先確定了最佳操作壓力;并考察了3種滲濾模型的脫鹽效果。結果顯示最佳操作壓力為8 bar;3種模型一般經過1 h處理，其肽截留率均可達96%以上，其中以連續恒容滲濾模型脫鹽效果最佳，在初始條件下(約pH8.0)，經90 min處理后，脫鹽率可達到76.82%;之后比較了玉米肽在不同酸度條件下的脫鹽率。研究表明:在8 bar的壓力下，采用連續恒容滲濾模型，于pH 7條件下脫鹽效果最好，90 min處理后，脫鹽率可達到87.80%。

玉米降壓肽 納濾 脫鹽 滲濾模型

玉米肽一般是以玉米蛋白為原料，經蛋白酶的催化水解、經一系列手段分離純化和低溫冷凍干燥，最終得分子質量在10 ku以下的寡肽混合物［1］。近年來，已有一些關于玉米肽具有良好降血壓活性的報道［2－3］，因此，建立一套適宜的分離提取技術工藝是將玉米降血壓肽推向商業化生產的必要條件，而分離純化的效率將直接影響到其應用前景。

由于在玉米濃縮蛋白制備過程中，需要進行醇沉和鹽析等步驟，加入了一定量的標準氫氧化鈉溶液和氯化鈉溶液［4］;并且在酶解過程中，隨著肽的不斷釋放，酸度不斷提高，在本研究中為了將玉米蛋白的酶解維持在pH 8，需要不斷加入NaOH溶液，以中和過量的H+，直到水解結束。上述步驟產生的鹽對高血壓病人是不利的，因此，有必要對玉米蛋白水解物進行脫鹽處理。

目前，針對食物源的短肽脫鹽技術主要包括離子交換層析法、凝膠過濾法、膜技術等［5］。納濾(Nanofiltration，NF)是以壓力差為推動力的一種膜分離過程，由于納濾膜具有納米級的孔徑，截留分子質量在100～1 000 u之間，并且其表面分離層由聚電解質所構成，所以其分離過程包括了篩分效應和道南(Donnan)效應兩種機理。道南效應是電荷效應，納濾膜帶有靜電官能團，基于靜電相互作用，對離子有一定的截留率［6－7］。肽帶有可離子化的官能團如羧基或氨基，偏離等電點時帶電荷，而鹽是帶電荷的電解質。在納濾脫鹽過程中，當蛋白水解物經過納濾膜時，由于納濾膜對蛋白水解物中的鹽和其他組分的透過是有選擇性的，即納濾膜允許低分子質量的小肽、氨基酸和帶單電荷的鹽分透過，而其他分子質量較大的組分則被截留。這樣，鹽分就隨著滲濾溶劑透過納濾膜而被不斷去除，從而達到對物料的除鹽目的。納濾分離過程具有無化學反應、無需加熱、無相轉變、不會破壞生物活性等特征，因而越來越廣泛地被應用于食品、醫藥工業中的各種分離、濃縮和除鹽過程中。將超濾和納濾技術聯用對蛋白水解液進行分離，利用超濾的篩分原理，首先用截留分子質量較大的超濾膜，除去無生理活性的未水解的蛋白和其他大分子物質，或通過超濾膜先對活性肽進行分級分離;然后利用納濾膜進行脫鹽。

在優化超濾法制備玉米降血壓肽條件的基礎上［8］，進一步采用截留分子質量為160 u的納濾膜，考察了3種滲濾條件下對玉米蛋白酶解液的脫鹽效果，旨在確定具有最佳的脫鹽效果的模型，為今后進行工業化生產玉米降血壓肽的脫鹽提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

玉米黃粉(含粗蛋白64.94%):正大集團武漢分公司。化學試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器

PB－10型精密pH計:賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;UV－2000紫外可見分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司;LNG－NF－101納濾膜分離設備，US16/1812型納濾膜(截留分子質量160 u):上海朗極化工科技有限公司;Model 410火焰光度計:英國Sherwood科學儀器有限公司。

圖1 納濾試驗裝置示意圖

1.3 試驗方法

1.3.1 濃縮玉米蛋白的制備

按文獻［4］的方法制備濃縮玉米蛋白，經凱氏定氮法測得其含粗蛋白83.91%。

1.3.2 玉米蛋白酶解液的制備［8］

適量濃縮玉米蛋白→按料液比1∶25(體積比)加蒸餾水→100℃預處理30 min→冷卻→調節溫度到55℃、pH8.0→按酶底比1∶100加入Alcalase堿性蛋白酶→反應4 h，并保持溫度為55℃，pH8.0→沸水浴10 min滅酶→冷卻后抽濾→通過3 ku超濾膜→得到分子質量＜3 ku玉米蛋白酶解液，收集備用。

1.3.3 納濾膜處理的脫鹽過程［9－11］

圖1為納濾裝置的示意圖，操作過程中利用流動水的冷凝作用將溫度保持在20℃。首先是確定操作壓力，然后比較3種納濾滲透模型對料液中肽的截留和脫鹽效率。

1.3.3.1 模型1(M1):稀釋－濃縮－稀釋的間歇恒容滲濾過程

如圖2所示V0為酶解液的初始體積，取Vd=2V0或3V0，即將原酶解液稀釋至原體積的2倍或3倍，當透過液體積濃縮為初始體積V0時為一次循環過程，第一次的濃縮階段稱為預濃縮階段。每輪濃縮前，進行3 min的全回流操作。每一輪結束后加水使體系體積為Vd，不斷循環，直至達到脫鹽目的，過程中不時取樣測定肽和鹽(Na+)的截留率。

圖2 稀釋－濃縮－稀釋的間歇恒容滲濾過程

1.3.3.2 模型2(M2):濃縮 －稀釋－濃縮的間歇恒容滲濾過程

如圖3所示，初始酶解液體積為V0，進行全循環3 min后，經納濾膜處理濃縮至Vr。Vr=1/2 V0或1/3 V0，再加水稀釋至V0，即每次加水與透過液的體積相同。與模型1相同，第一次的濃縮階段稱為預濃縮階段。每輪濃縮前，進行3 min的全回流操作。不斷循環，直至達到脫鹽目的，過程中不時取樣測定肽和鹽(Na+)的截留率。

圖3 濃縮－稀釋－濃縮的間歇恒容滲濾過程

1.3.3.3 模型3(M3):連續恒容滲濾過程

在該過程中，將去離子水連續加入至體系中，其加入的體積與經納濾膜透過液的量相等，從而使體系總體積保持不變，同樣在過程中不時取樣測定肽和鹽(Na+)的截留率。

1.3.4 肽截留率的測定

采用微量雙縮脲法測定肽濃度［12］。根據物料平衡定律，肽截留率按下式計算:

式中:C0為初始料液的肽濃度，V0為初始料液的體積，Ci和Vi分別為透過液的肽濃度和相應的體積。

1.3.5 料液中 Na+含量的測定［13－14］

標準鈉溶液的配制:稱取已于500～600℃下灼燒至恒重的1.271 g光譜純氯化鈉于1 000 mL容量瓶中，定容、搖勻為鈉標準溶液(1 mL相當于0.5 mg鈉)。

標準曲線的繪制:在數只50 mL的容量瓶中，分別加入 0.0、0.4、1.2、1.6、2.4、2.8、4.0、6.4、8.0 mL鈉標準溶液，用水稀釋至刻度、搖勻(溶液的鈉質量濃度分別為 0、4、12、16、24、28、40、64、80 μg/mL)。用火焰光度計進行測定。以鈉含量為橫坐標，相對應的特征譜線強度值為縱坐標，繪制標準曲線。

鹽截留率按下式計算:

鹽(Na+)截留率%=C'i× V'i/C0'× V0'

式中:C0'為初始料液的Na+濃度，V0'為初始料液的體積，C'i和V'i分別為截留濃縮液的Na+濃度和相應的體積。

1.4 數據處理

文中所有測得數據均為3次試驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 最佳納濾溫度及壓力的確定

首先要確定操作溫度，一般來說，溫度越高，料液體系的溶解度越高，對膜污染造成的壓力越小，但是過高的溫度不但會影響蛋白質結構的穩定性，而且設備本身也有一定的耐受溫度上限，綜合考慮本研究將操作溫度控制在20℃。

操作壓力是納濾過程最重要的運行參數之一。圖4為不同操作壓力下，納濾膜對肽和鹽的截留率。由于納濾膜分離設備的壓力極限為14 bar，而壓力過低無法達到良好的納濾脫鹽效果，因此選擇4～12 bar作為考察范圍。從圖4可以看出，壓力在4～8 bar范圍內，隨著操作壓力的增加，膜對肽的截留率在小幅下降后呈上升趨勢，對鹽截留率逐漸下降，脫鹽效果即已顯現;而繼續增加壓力，則肽損失率增加，并且脫鹽能力基本不再增加。因此綜合考慮，選擇8 bar作為納濾的操作壓力。

圖4 不同壓力下的肽及鹽的截留率

2.2 間歇恒容滲濾過程預濃縮階段肽截留率及鹽截留率的變化

由前述方法可知，間歇恒容滲濾過程共采用了兩種模型，每種模型又分別通過兩個體積濃縮倍數(VCR)進行考察(即VCR=2或3)。

圖5 不同納濾過程預濃縮階段的肽/鹽截留率

由圖5可知，在間歇滲濾過程中，無論是模型1還是模型2，僅僅經過第一輪的預濃縮階段，其結果均不理想，因為肽截留率均較低，大約在64% ～78%之間，同時鹽濃度反而有所上升，即經過預濃縮階段鹽分反而被濃縮了。導致此現象產生的原因主要是在設備運行初期納濾膜對肽的較強的吸附作用，導致截留液中肽濃度有所降低，同時料液被迅速濃縮，也使鹽分被濃縮至截留液中。因此，納濾的進行需要加入大量的滲濾溶劑，即去離子水，對料液進行多輪循環操作，才能達到良好的脫鹽效果。

2.3 3種納濾模型的全過程比較

2.3.1 稀釋－濃縮－稀釋的間歇恒容滲濾過程

圖6顯示了不同濃縮倍數的料液在稀釋－濃縮－稀釋的間歇恒容滲濾模型(模型1)下的肽及鹽分截留率的變化趨勢。在預濃縮階段，肽截留率大幅下降，此后隨著滲濾溶劑(去離子水)的不斷加入，肽截留率出現回升，經過5輪循環，約經過80 min，M1(VCR=2)和M1(VCR=3)出現重合點，且此后再經過幾輪循環，肽的截留率均無大的變化，較平穩地保持在98%左右。鹽的截留率在經過了預濃縮階段的濃縮之后，在第一輪的循環中即出現大幅的下降。此后，在60 min時M1(VCR=3)的鹽截留率為(61.45±2.86)%，在經過多輪循環后亦無太大變化。而M1(VCR=2)鹽截留率一直呈下降趨勢，即脫鹽率在不斷提高，在運行至133.5 min時，鹽截留率為(45.5±3.79)%，即脫鹽率可以達到54.5%。

2.3.2 濃縮－稀釋－濃縮的間歇恒容滲濾過程

圖7顯示了不同濃縮倍數的料液在濃縮－稀釋－濃縮的間歇恒容滲濾模型下(模型2)肽和鹽分截留率的變化趨勢。同樣在預濃縮階段，肽截留率大幅下降，但隨著滲濾溶劑(去離子水)的加入，經過3輪循環，約62 min，M2(VCR=2)和 M2(VCR=3)的肽截留率均可達到96.00%以上。就鹽截留率而言，M2(VCR=3)隨著循環次數的增加穩步下降，即脫鹽率穩步提高;而M2(VCR=2)在70 min時出現大幅的降低，到76 min時，脫鹽效果達到最佳，截留率為(44.00 ±3.27)%，即脫鹽率達56.00%。

圖7 模型2全過程不同時間肽及鹽截留率的變化

2.3.3 連續恒容滲濾過程

連續恒容滲濾過程是一個特殊的模型，此模型沒有經過前期的預濃縮。同樣先經過5 min的循環，使料液與設備和納濾膜充分接觸。之后，在開始納濾操作時，就不斷向料液中加水，始終保持加入的水的體積與透過液體積相當。

由圖8可知，納濾初期，此模型下的肽和鹽分截留率總體趨勢和前兩個模型類似。但由于純水不斷加入，減小了大分子物質對膜的污染，所以肽截留率可以迅速回升，并保持在較高的水平。而對鹽分的截留率在70 min后即可達到40.00%以下，在90 min時可以達到(23.18 ± 2.12)%(脫鹽率為76.82%)。在這3種模型中，其脫鹽效果是最佳的。

圖8 模型3全過程不同時間肽及鹽截留率的變化

2.4 不同pH對脫鹽效果的影響

就脫鹽效果而言，模型3即連續恒容滲濾模型最好，故選擇在此模型下比較不同pH對脫鹽效果的影響。鑒于納濾膜有一定的耐受pH范圍，所以選擇了 pH 5、6、7、8、9 這5 個點進行考察。在這 5 種 pH條件下，鹽分截留率變化的趨勢均是前10 min鹽分被濃縮，隨著滲濾溶劑的加入，鹽分不斷被脫除。如圖9a所示，在酸性條件下，特別是pH 5時，直到80 min脫鹽率才會達到(54.87 ±3.09)%，95 min 時達到最低，為(71.34 ±2.52)%;而 pH 6 在70 min即可到達(69.67±2.78)%，在 90 min時效果最好，為(75.48±5.02)%。但由于 pH 5和 pH 6已經接近玉米肽的等電點，料液的溶解性變低，會導致更多的顆粒吸附在膜上，使分離效果變差。

如圖9b所示，在堿性條件下，pH 8時直到30 min脫鹽率都無明顯變化，但后期降幅很大，90 min時，脫鹽率到達(76.82±2.12)%。pH 9呈緩慢下降趨勢，但效果并不佳，到95 min時脫鹽率才達(67.64±2.98)%。由圖9b可知在中性條件下，即pH 7時的脫鹽效果最好，在20 min時，鹽分截留率就有了明顯的下降，之后更是一路降低，90 min到達最低，此時脫鹽率達(87.80±4.98)%。

3 討論

3.1 納濾面臨的問題及解決方法

納濾過程中最為常見的問題是膜的濃差極化和污染，為了減少這些問題的影響，本研究采用了滲濾(diafiltration)的方法，即將截留物用滲濾溶劑(如水)不斷稀釋而將低分子質量溶質逐漸沖走，并透過膜;使大分子質量的溶質稀釋后沖離膜表面，減少對膜的污染，從而增大膜通量，因而提高了被截組分和透過組分的分離度。滲濾可以彌補膜分離方法中的一些不足之處，如克服高濃度料液分離時透過通量低的缺點，它能使目標分子被截留，而雜質小分子可以順利通過濾膜［15］。

3.2 不同模型的最佳參數點比較

滲濾過程可分為間歇恒容與連續恒容。在本研究中又因為預濃縮階段的稀釋/濃縮倍數的不同，將間歇恒容分為了4種形式進行了考察。

圖6和圖7顯示了間歇恒容滲濾過程的肽以及鹽分截留率隨時間變化的情況——整個過程中肽截留率隨時間發生往復變化。每一輪濃縮操作中，由于納濾膜的篩分效應和道南效應，肽截留率隨過程時間延長先下降，加水稀釋后，肽截留率又上升到一個峰值，接著又開始新一輪的濃縮操作，如此不斷往復，但整個過程中肽截留率整體的變化趨勢是循環往復上升的。同樣的，鹽截留率隨著時間的延長也出現了往復的變化，即在每一輪納濾濃縮操作階段，隨著滲濾溶劑(水)的加入，膜對鹽分的截留率是逐漸減小的，這是因為截留液中鹽的分子質量小，通過篩分效應可除去;對于160 u的納濾膜，是以篩分效應起主要作用的，只有極少數的二肽及大部分的游離氨基酸可以透過膜，故該膜表現為對肽類高的截留率和對鹽分的較高的脫除率。

圖8顯示了連續恒容滲濾過程的肽和鹽分截留率的變化情況，初始階段同樣是一定程度的濃縮，在后期一直加水的過程中，肽不斷地被濃縮，鹽分也逐漸被脫除。

隨著操作的不斷進行，納濾膜表面上的肽濃度會增加，導致膜面上凝膠層的形成，加水后的循環沖刷也并不能完全消除，致使凝膠層逐漸積累增厚。由試驗可知，通常在50 min之后，肽截留率即可達到95%以上。而要達到良好的脫鹽效果，則所需較長的時間。就脫鹽率而言，模型3，即連續恒容滲濾過程最佳。但是此模型需要在納濾過程中不斷加水，耗水量增加，故增加了生產成本。因此，要根據實際情況，即對想要達到的目的和成本進行綜合考慮，選擇適合的納濾模型。當選擇模型2中VCR=2時，脫鹽率雖有所降低，但節省了時間和能源，與最佳模型相比，可節省時間20%，用水量也可降低54.54%，是一種較經濟的脫鹽方式。

3.3 pH對納濾過程的影響

圖12是在不同pH時料液的鹽分截留率的變化圖。由圖9可知，在酸性條件下濃縮液中截留的鹽分較高，脫鹽效果較差。因為此時的pH接近玉米肽的等電點，在等電點附近的酶解液已經開始有少許渾濁，溶解度下降，肽聚集，易在膜面形成凝膠層，造成濃差極化甚至膜污染，這同時也阻礙了鹽分的脫除。而在堿性條件下，體系中的游離氨基在分子內部或分子間形成氫鍵，使溶液黏度變大。pH越高，分子越易在膜面聚集，從而增大了Na+離子的透過阻力。相比較而言，pH 6的酸性條件下，納濾膜對酶解液的脫鹽性能與pH 8的堿性條件下基本相當。只有當酶解液在中性條件下進行納濾脫鹽時，其脫鹽效果才是最佳的。

4 結論

納濾最佳的操作壓力為8 bar，3種工藝操作模型(稀釋－濃縮－稀釋的間歇恒容滲濾、濃縮－稀釋－濃縮的間歇恒容滲濾和連續變容滲濾)中，以連續變容滲濾模型脫鹽效果最佳，90 min后，肽截留率為98.49%，脫鹽率為 76.82%;在 pH 7 時，經過 90 min，脫鹽率可達到87.80%。

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Study on Desalination of Corn Antihypertensive Peptides by Nanfiltration Technology

Du Jing He Hui Lin Minli Li Jiangtao Zhang Wenjun
(College of Food Science ＆ Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070)

In order to prepare antihypertensive corn peptides desalted and separated by ultrafiltration，the hydrolysate solution was treated by nanofiltration membrane.Then，the best operating pressure and diafiltration models were chosen by comparing the retention rate of peptides/salt(Na+).The results showed that the optimal operating pressure was 8 bars;the retention rates of peptides in three diafiltration models could all reach 96%after 1h.The model 3(namely continuous volume － constant diafiltration model)was the best，of which desalination rate was 67.64%after 95min.Then，the desalination effects of peptides were compared under different pH and optimal parameters.Conclusion:Under 8 bars and pH 7，the continuous volume － constant diafiltration model was the best choice for desalination and the desalination rate was 87.80%after 90min treatment.

antihypertensive corn peptides，nanofiltration，desalination，diafiltration models

Q514

A

1003－0174(2011)11－0088－06

863計劃(2008AA10Z314)

2010－12－07

杜璟，女，1985年出生，碩士，食品化學

何慧，女，1960年出生，教授，食品化學和天然產物化學