基于負(fù)二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜的反式脂肪酸的快速測定

陶 健 丁太春 馮 波 蔣煒麗 楊智靈 蘇 亮

(河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院國家糧油及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，鄭州 450004)

基于負(fù)二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜的反式脂肪酸的快速測定

陶 健 丁太春 馮 波 蔣煒麗 楊智靈 蘇 亮

(河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院國家糧油及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，鄭州 450004)

建立了基于負(fù)二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜的反式脂肪酸的快速測定方法。以三反油酸甘油酯和三油酸甘油酯混合標(biāo)樣系列為校正集，使用帶有水平衰減全反射(HATR)附件的傅里葉變換紅外光譜儀采集校正集樣品在1 050～900 cm－1波段范圍的吸收光譜，求二階導(dǎo)數(shù)，乘以－10 000，得負(fù)二階導(dǎo)數(shù)譜(－2D－HATRFTIR)。以970～960 cm－1波段范圍的最大峰高為X軸，以三反油酸甘油酯含量為Y軸，構(gòu)建定標(biāo)方程為Y=0.348 8X－0.918 5，相關(guān)系數(shù)0.999 5。在0.5%～60%范圍，驗證集樣品反式脂肪酸含量預(yù)測值與實際指定值顯著相關(guān)，驗證相關(guān)系數(shù)0.999 0，相對殘差的絕對值小于10%，表明方法定標(biāo)模型預(yù)測性能良好。方法檢測下限達(dá)0.5%，改善了現(xiàn)有紅外光譜法的靈敏度，適用于較低含量反式脂肪酸的快速測定。

反式脂肪酸 傅里葉變換紅外光譜 水平衰減全反射 負(fù)二階導(dǎo)數(shù)

在反式脂肪酸對人身健康的危害不斷被發(fā)現(xiàn)、多國政府先后立法限制反式脂肪酸以及全社會共同關(guān)注的背景下，反式脂肪酸的測定成為研究熱點，其中紅外光譜法發(fā)展迅速，日益完善，有望實現(xiàn)反式脂肪酸快速準(zhǔn)確的測定。反式脂肪酸分子結(jié)構(gòu)中孤立反式雙鍵在966 cm－1處表現(xiàn)特征吸收，吸收強(qiáng)度與反式雙鍵的多少在一定范圍內(nèi)符合比爾定律，此為紅外光譜法定量反式脂肪酸的基本原理。與氣相色譜法相比，紅外光譜法的優(yōu)點是快速簡單，最大的缺點是靈敏度低［1－3］。縱觀紅外光譜法的發(fā)展歷程，操作簡單化和提高靈敏度是貫穿始終的主導(dǎo)思想。從傳統(tǒng)的 AOAC 965.34、AOAC 994.14 和 AOCS Cd 14 －95 到 AOAC 2000.10 和 ISO 13884:2003［4－8］，操作程序越來越簡單，分析速度越來越快，但測定下限從未低于 5%，AOCS Cd 14d－99［9］要求以與樣品脂肪酸組成一致并且不含反式脂肪酸的油樣作為參比，但理想的參比油樣很難獲得，實際測定下限遠(yuǎn)高于1%的理論檢出限。本文在相關(guān)研究的基礎(chǔ)上［10－11］，構(gòu)建一種新的基于負(fù)二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜的反式脂肪酸的快速測定方法，改善了現(xiàn)有紅外光譜法的靈敏度，適合于測定較低含量的反式脂肪酸。

1 材料與方法

1.1 試劑

三油酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品:美國sigma公司;三反油酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品:美國Nu Check公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectrum One傅里葉變換紅外光譜儀:Perkin Elmer公司，配備HATR附件(ZnSe晶體材料)和DTGS檢測器;AG285電子天平:Mettler Toledo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 校正集樣品的制備

準(zhǔn)確稱取三反油酸甘油酯(X g)和三油酸甘油酯［(0.3－X)g］于5 mL燒杯中，60℃水浴加熱，混合均勻，其中 X 分別為 0.000 00，0.001 50，0.003 00，0.006 00，0.009 00，0.015 00，0.030 00，0.060 00，0.120 00，0.150 00，0.180 00，配制成三反油酸甘油酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)別為0%，0.5%，1%，2%，3%，5%，10%，20%，40%，50%，60%的校正集樣品。

1.3.2 校正集樣品光譜的采集及數(shù)學(xué)處理

依次吸取適量制備好的校正集樣品，加到HATR附件的ZnSe晶體上，使樣品覆蓋整個晶體表面，立即采集其在1 050～900 cm－1波段范圍的水平衰減全反射傅里葉變換紅外吸收光譜(HATR－FTIR)。對光譜求二階導(dǎo)數(shù)，然后乘以－10 000，得到負(fù)二階導(dǎo)數(shù)光譜(－2D－HATR－FTIR)。

1.3.3 構(gòu)建標(biāo)定方程

以校正集樣品三反油酸甘油酯含量為Y軸，以970 cm～960 cm－1波段范圍內(nèi)對應(yīng)的最大峰高為X軸，構(gòu)建一元線性回歸定標(biāo)方程。

1.3.4 定標(biāo)方程的驗證

選擇11份已知反式脂肪酸含量的樣品為驗證集，按照與校正集樣品相同的方式采集和處理光譜，應(yīng)用定標(biāo)模型預(yù)測樣品反式脂肪酸含量，然后通過預(yù)測值與實際指定值的相關(guān)性分析和殘差分析對定標(biāo)方程進(jìn)行驗證。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用紅外光譜儀Spectrum v 6.3.5工作站及Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 三反油酸甘油酯的紅外吸收光譜

三反油酸甘油酯在1 050～900 cm－1波段范圍的水平衰減全反射傅里葉變換紅外吸收情況見圖1。由于孤立反式雙鍵中CH官能團(tuán)的平面振動變形，反式脂肪酸在966 cm－1處表現(xiàn)特征吸收，吸收強(qiáng)度與其在樣品中的含量相關(guān)，吸收特性與脂肪酸碳鏈的長短和反式雙鍵的位置無關(guān)。同時，脂肪酸分子結(jié)構(gòu)中羧基在該波段范圍存在干擾吸收，嚴(yán)重傾斜的譜圖基線直接影響測定的準(zhǔn)確性，尤其是對于反式脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低(≤5%)的樣品，特征吸收峰不再明顯，定量測定相當(dāng)困難。這是造成目前紅外光譜法靈敏度不高的重要原因。

圖1 三反油酸甘油酯的水平衰減全反射傅里葉變換紅外吸收光譜

三反油酸甘油酯的負(fù)二階導(dǎo)數(shù)光譜見圖2。經(jīng)過求負(fù)二階導(dǎo)數(shù)數(shù)學(xué)處理，基線由傾斜變?yōu)樗剑舅岱肿咏Y(jié)構(gòu)中羧基的干擾吸收現(xiàn)象在譜圖上得到校正，可直接以空氣為參比進(jìn)行反式脂肪酸的測定，無需參比油樣;反式脂肪酸分子結(jié)構(gòu)中的孤立反式雙鍵在966 cm－1處的特征吸收峰得以凸顯，吸收譜帶明顯變窄，強(qiáng)化了光譜特征，提高了分辨率，有利于識別和消除共軛脂肪酸和飽和脂肪酸等造成的鄰近966 cm－1的光譜吸收干擾。從而有效提升方法靈敏度。

圖2 三反油酸甘油酯的負(fù)二階導(dǎo)數(shù)水平衰減全反射傅里葉變換紅外吸收光譜

2.2 定標(biāo)方程

基于負(fù)二階導(dǎo)數(shù)光譜構(gòu)建的反式脂肪酸的定標(biāo)曲線見圖3。定標(biāo)方程為Y=0.348 8X －0.918 5，線性相關(guān)系數(shù)0.999 5。結(jié)果表明，在0.5%～60%范圍內(nèi)，驗證集樣品的反式脂肪酸含量與對應(yīng)的吸收強(qiáng)度(峰高)成正比，符合比爾定律。

圖3 反式脂肪酸定標(biāo)曲線(峰高對反式脂肪酸含量)

2.3 樣品預(yù)測相關(guān)性分析

對于一個好的定標(biāo)模型，理想的定標(biāo)信息和參數(shù)固然重要，更重要的是具備精準(zhǔn)的預(yù)測性能。11份驗證集樣品反式脂肪酸含量預(yù)測情況見表1，以實際指定值為X軸，以預(yù)測值為Y軸，對驗證集樣品反式脂肪酸含量的預(yù)測值與實際指定值進(jìn)行一元線性相關(guān)回歸分析的結(jié)果見圖4，相關(guān)系數(shù)0.999 0。可見，預(yù)測值與實際指定值顯著線性相關(guān)，表明定標(biāo)方程預(yù)測性能良好。

表1 驗證集樣品反式脂肪酸含量預(yù)測和殘差分析

圖4 驗證集樣品反式脂肪酸含量預(yù)測值與實際指定值的相關(guān)性分析

2.4 樣品預(yù)測殘差分析

對驗證集樣品反式脂肪酸含量的預(yù)測情況進(jìn)行殘差分析，數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。殘差是實際指定值與預(yù)測值的差值，反映了預(yù)測值與實際指定值在數(shù)值和方向上的偏離情況，殘差分布見圖5。

圖5 驗證集樣品反式脂肪酸含量預(yù)測值與實際指定值的殘差分布

為更加直觀的表征預(yù)測值與實際指定值的偏離程度，進(jìn)一步進(jìn)行相對殘差分析，結(jié)果見圖6。可見，當(dāng)驗證集樣品反式脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于10%，相對殘差的絕對值小于5%;當(dāng)驗證集樣品反式脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%～10%，相對殘差的絕對值小于10%。殘差分析進(jìn)一步驗證了定標(biāo)模型可靠的預(yù)測性能。

圖6 驗證集樣品反式脂肪酸含量預(yù)測值與實際指定值的相對殘差分布

3 結(jié)論

建立了基于負(fù)二階導(dǎo)數(shù)水平衰減全反射傅里葉變換紅外光譜的反式脂肪酸的快速測定方法。當(dāng)樣品反式脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%～60%，定標(biāo)模型預(yù)測性能良好。與傳統(tǒng)的紅外光譜法相比，負(fù)二階導(dǎo)數(shù)法操作簡便，直接以空氣為背景采集光譜，無需參比油樣;光譜特征增強(qiáng)，分辨率大大提升，能有效識別和消除共軛脂肪酸和飽和脂肪酸等產(chǎn)生的光譜干擾。更具意義的是，當(dāng)今國際上食品中反式脂肪酸限量標(biāo)準(zhǔn)多在1% ～5%，正好落在負(fù)二階導(dǎo)數(shù)法的測定下限以上，突破了傳統(tǒng)紅外光譜法因為只能測定食品中高含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于5%)反式脂肪酸而難以廣泛應(yīng)用中的尷尬局面。可見，負(fù)二階導(dǎo)數(shù)法非常適合于食品中較低含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于5%)反式脂肪酸的快速測定，在日益嚴(yán)峻的食品安全監(jiān)測領(lǐng)域的應(yīng)用前景不可估量。

［1］AOCS official method Ce 1h －05.Determination of cis－，trans－，saturated，monounsaturated and polyunsaturated fatty acids in vegetable or non－ruminant animal oils and fats by capillary GLC［S］

［2］Mossoba M M，Milosevic V，Milosevic M，et al.Determination of total trans fats and oils by infrared spectroscopy for regulatory compliance［J］.Analytical Bioanalytical Chemistry，2007，389(1):87 －92

［3］Milosevic M，Milosevic V，Kramer J K G，et al.Determining low levels of trans fatty acids in foods using an improved ATR － FTIR procedure［J］.Lipid Technology，2004，16(11):252－255

［4］AOAC official method 965.34.Isolated trans isomers in margarines and shortenings infrared spectrometric method［S］

［5］AOAC official method 994.14.Isolated trans unsaturated fatty acid content in partially hydrogenated fats infrared spectrophotometric method［S］

［6］AOCS official method Cd 14 －95.Isolated trans isomers infrared spectrometric method［S］

［7］AOAC official method 2000.10.Determination of total isolated trans unsaturated fatty acids in fats and oils ATR－FTIR spectroscopy［S］

［8］ISO 13884:2003.Animal and vegetable fats and oils－ Determination of isolated trans isomers by infrared spectrometry［S］

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Rapid Determination of Trans Fatty Acids by Negative Second Derivative Horizontal Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared Spectroscopy

Tao Jian Ding Taichun Feng Bo Jiang Yili Yang Zhiling Su Liang
(Henan Institute of Product Quality Inspection and Supervision，National Grain Oil＆ Meat－food Product Supervision and Inspection Center，Zhengzhou 450004)

A rapid method was developed to determine trans fatty acids in foods using negative second derivative horizontal attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy(－2D－HATR－FTIR).Mixtures of trielaidin and triolaidin were prepared as a calibration set，the spectra in the region from 1 050 to 900 cm－1was collected by the Fourier transform infrared spectroscopy with HATR accessory，to obtain a second derivative procedure，which was then multiplied with －10 000.Calibration plot and regression equation of－2D－HATR－FTIR band heights versus TFAs were obtained as(Y=0.348 8X － 0.918 5)，with the correlation coefficient of 0.999 5，which was thereafter validated by a validation set.Predicted concentrations were significantly correlated with specified concentrations for the TFAs levels in validation set samples at the TFAs levels from 0.5%to 60%.The correlation coefficient reached 0.999 5，while the relative residual was below 10%.It was suggested that calibration model predicted the TFAs levels in samples accurately.The enhanced spectral features of a negative second derivative resolved issues that traditionally limited the sensitivity of the previous infrared methodology.Low levels of TFAs in foods could be rapidly determined with the present method.

trans fatty acids，F(xiàn)ourier transform infrared spectroscopy，horizontal attenuated total reflection，negative second derivative

TS207.3

A

1003－0174(2011)11－0115－04

國家質(zhì)檢總局科技計劃(2010QK115)，河南省科技攻關(guān)項目(082109006000)

2010－12－01

陶健，男，1978年出生，工程師，食品科學(xué)