TMPRSS4基因沉默對胰腺癌SW1990細胞生長及侵襲的影響

王煥景 智發朝 趙芯梅 青海濤 倫偉健 周三喜 郭文 程天明 姜泊

·論著·

TMPRSS4基因沉默對胰腺癌SW1990細胞生長及侵襲的影響

王煥景 智發朝 趙芯梅 青海濤 倫偉健 周三喜 郭文 程天明 姜泊

目的觀察TMPRSS4基因沉默對人胰腺癌SW1990細胞體外生長增殖和侵襲的影響。方法體外合成4個靶向TMPRSS4基因和陰性對照的真核表達載體，瞬時轉染到SW1990細胞，實時定量PCR法檢測轉染細胞的TMPRSS4 mRNA表達。以干擾效率最高的真核表達載體轉染SW1990細胞， G418篩選出穩定的TMPRSS4基因沉默的細胞株，蛋白質印跡法檢測穩定細胞株 TMPRSS4蛋白抑制效率，CCK-8法檢測細胞生長抑制率，Transwell小室檢測細胞侵襲能力。結果成功構建了穩定下調TMPRSS4表達的細胞株SW1990/psi-TMPRSS4， 細胞轉染效率為82.9%。與親本SW1990細胞比較，TMPRSS4 mRNA和蛋白水平分別下調了80.1%、60%。 SW1990/psi-TMPRSS4組穿膜細胞數為(118.6±13.4)個，顯著低于陰性對照組的(157.4±12.9)個和親本細胞組的(157.0±9.5)個(P值均<0.01)。SW1990/psi-TMPRSS4組細胞的侵襲抑制率為24.5%。但各組細胞增殖無明顯變化。結論成功篩選出穩定下調TMPRSS4表達的細胞株。下調TMPRSS4表達能有效抑制胰腺癌SW1990細胞的侵襲能力，但對細胞增殖無影響。

胰腺腫瘤； 小分子干擾RNA; 基因沉默； TMPRSS4; SW1990細胞

跨膜絲氨酸蛋白酶4(type Ⅱ transmembrane serine proteases 4，TMPRSS4)是Wallrapp等[1]在2000年從胰腺癌中分離出的糜蛋白家族(TTSPs)中的一個新的絲氨酸蛋白酶，它具備TTSP所有的結構特征，功能上有胰酶樣活性，可能在腫瘤轉移及浸潤中有重要作用。Jung等[2]研究證實，TMPRSS4過表達誘導E-鈣粘蛋白介導的細胞粘連喪失，從而促進表皮細胞-間質細胞轉變，使癌細胞的轉移、侵襲能力和惡性程度明顯增加。本研究觀察胰腺癌SW1990細胞TMPRSS4基因表達沉默后細胞的增殖及侵襲行為的變化，探討TMPRSS4與胰腺癌浸潤轉移的關系。

材料和方法

一、細胞培養

SW1990胰腺癌細胞由本實驗室保存，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基常規培養、傳代。收集對數生長期細胞進行實驗。

二、靶向TMPRSS4的shRNA的設計、合成及真核表達質粒的構建

根據Gen-Bank(NM-019894.3)序列設計4個靶向TMPRSS4基因的shRNA，分別為TMPRSS4-1：GGATCTGGATGTTGTTGAAAT；TMPRSS4-2：GCTGCA-GTTCCACTCACTTT；TMPRSS4-3：GGGAAGTCACCG-AGAAGATGA；TMPRSS4-4：GCTGCAGTTCCCACTCACTTT。同時合成陰性對照NC-shRNA，序列為GTTCTCCGAACGTGTCAGT。由上海吉瑪公司合成真核載體，分別命名為psi-TMPRSS4-1、psi-TMPRSS4-2、psi-TMPRSS4-3、psi-TMPRSS4-4、psi-NC。真核載體內含GFP熒光蛋白。

三、細胞瞬時轉染及真核表達載體的選擇

SW1990細胞以8×105個/ml接種于6孔板，培養24 h后用無血清DMEM高糖培養液分別加入4個psi-TMPRSS4和psi-NC各4 μg以及10 μl LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)轉染8 h，換含有10%胎牛血清的培養液繼續培養48 h。以未轉染細胞作為對照組。分別收集各組細胞，抽提細胞總RNA，逆轉錄cDNA，然后行實時定量PCR檢測轉染細胞TMPRSS4 mRNA表達。引物序列：TMPRSS4上游5′-CCGATGTGTTCAACTGGAAG-3′，下游5′-CCCATCCAATGATCCAGAGT-3′；內參GAPDH上游5′-TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3′，下游5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3′，引物由上海生工公司合成。PCR擴增條件：50℃ UDG孵育2 min，95℃ 2 min；95℃ 15 s、60℃ 30 s，40個循環。每組設3個復孔。應用2-△△CT法計算轉染各組的RQ值。

四、穩定轉染細胞株的篩選

以1.0×105個/ml接種于24孔板中，psi-TMPRSS4-2轉染SW1990細胞，培養8 h后換含10%胎牛血清的培養液，48 h后以終濃度為600 μg/ml的G418(Gibco公司)進行篩選。4周后挑取抗性克隆，用有限稀釋法將挑取的克隆在96孔板中用含600 μg/ml G418的培養液擴大培養。待長出單細胞克隆后移入培養瓶以300 μg/ml的G418維持濃度繼續培養。得到的穩定干擾TMPRSS4基因的細胞株命名為SW1990/psi-TMPRSS4。同時陰性siRNA 轉染的細胞命名為SW1990/psi-NC。

五、蛋白質印跡法檢測TMPRSS4蛋白表達

提取SW1990、SW1990/psi-NC、SW1990/psi-TMPRSS4三組細胞的總蛋白，常規行蛋白質印跡法。兔抗人TMPRSS4多抗(GLP公司)1∶500稀釋。以β-actin為內參。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件計算各條帶灰度值，以目的條帶與β-actin灰度比值表示蛋白相對表達量。蛋白表達抑制率=(對照組值-實驗組值)/對照組值×100%。

六、Transwell小室法檢測細胞侵襲力

收集對數生長期細胞，無血清培養基洗滌2次后調整細胞密度為1×106/ml。加100 μl細胞懸液于Transwell上室(Corning公司)，加500 μl含10%胎牛血清的完全培養基于下室，37℃培養24 h后擦去上室側未穿膜細胞，4%多聚甲醛固定10 min，結晶紫染色5 min，蒸餾水洗數次，空氣中風干。選取5個高倍視野，計數穿膜細胞數。侵襲抑制率=(對照組侵襲穿膜細胞數-實驗組侵襲穿膜細胞數)/對照組侵襲穿膜細胞數×100%。

七、CCK-8法檢測細胞增殖

將對數生長期的SW1900、SW1900/psi-NC、SW1900/psi-TMPRSS4細胞以1×104個/ml接種在96孔板中，每孔100 μl，培養24、48、72 h后分別加入10 μl CCK-8原液，繼續培養2 h，測450 nm波長的吸光度(A450)值。每組設5個復孔。

八、統計學處理

結 果

一、靶向TMPRSS4真核表達載體的選擇

對照組、psi-NC及psi-TMPRSS4-1、2、3、4組的RQ值分別為1.000、0.964、0.337、0.199、0.573、0.354；基因表達沉默率分別為0、3.6%、66.3%、80.1%、42.7%、64.6%，以psi-TMPRSS4-2干擾效率最高。故選其進行以下實驗。

二、TMPRSS4真核表達載體轉染率及TMPRSS4 mRNA表達沉默效果

未轉染質粒的SW1990細胞在熒光顯微鏡下未見綠色熒光。轉染質粒的細胞可見綠色熒光(圖1)。SW1990/psi-NC細胞的TMPRSS4蛋白表達量較親本SW1990細胞抑制15%，而SW1990/psi-TMPRSS4細胞的TMPRSS4蛋白表達抑制率約為60%(圖2)。

圖1psi-NC(a)和psi-TMPRSS4(b)轉染的陽性SW1990細胞(×100)

圖2轉染后細胞TMPRSS4蛋白的表達(蛋白質印跡法)

三、轉染細胞體外侵襲力的變化

SW1990組、SW1990/psi-NC組、SW1990/psi-TMPRSS4組的平均穿膜細胞數分別為(157.0±9.5)、(157.4±12.9)和(118.6±13.4)個(圖3)，SW1990組與SW1990/psi-NC組間差異無統計學意義，但該兩組與SW1990/psi-TMPRSS4組差異均具有統計學意義(P值均=0.001 )。SW1990/psi-TMPRSS4組細胞的侵襲抑制率為24.5%。

四、轉染細胞增殖活性的變化

SW1990、SW1990/psi-NC、SW1990/psi-TMPRSS4三組細胞24 h的增殖活性分別為0.95±0.04、0.93±0.38、0.85±0.10；48 h為1.12±0.06、1.13±0.14、1.11±0.12；72 h為3.87±0.06、3.87±0.18、3.92±0.16，各組間差異均無統計學意義。

圖3SW1990組(a)、SW1990/psi-NC組(b)、SW1990/psi-TMPRSS4組(c)的穿膜細胞(結晶紫 ×200)

討 論

TMPRSS4也被稱為MT-SP2，定位于11q23.3?；蛉L48565 bp，共有13個外顯子， 437個氨基酸，分子質量為48000。Wallrapp等[1]報道， 13例原發性胰腺癌組織中9例TMPRSS4高表達，16株胰腺癌細胞系中10株高表達；而正常胰腺及慢性胰腺炎組織中未見TMPRSS4表達。但TMPRSS4與胰腺癌細胞生物學行為的關系尚不清楚。

SW1990細胞TMPRSS4表達量較高。為此，本實驗應用RNAi技術抑制SW1990細胞TMPRSS4基因表達。轉染后細胞TMPRSS4 mRNA表達水平較親本細胞下降80.1%，蛋白下降60%，表明干擾TMPRSS4成功。TMPRSS4沉默細胞的侵襲能力被抑制24.5%，證明TMPRSS4的表達與SW1990的侵襲轉移行為有密切關系。表明TMPRSS4可能并不參與細胞的增殖，TMPRSS4基因沉默不影響SW1990細胞的增殖。

[1] Wallrapp C, Hahnel S, Muller-Pillasch F, et al. A novel transmembrane serine protease (TMPRSS3) overexpressed in pancreatic cancer. Cancer Res, 2000, 60: 2602-2606.

[2] Jung H,Lee KP,Park SJ,et al.TMPRsS4 promotes invasion,migration and metastasis of human tumor cells by facilitating an epithelial-mesenchymal transition.Oncogene,2008,27:2635-2647．

2010-06-10)

(本文編輯：呂芳萍)

InfluenceofsilencingTMPRSS4expressionongrowthandinvasionofpancreaticcancerSW1990cell

WANGHuan-jing,ZHIFa-chao,ZHAOXin-mei,QINGHai-tao,LUNWei-jian,ZHOUSan-xi,GUOWen,CHENGTian-ming,JIANGBo.

InstituteofDigestiveMedicine，NanfangHospital，SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515，China

Correspodingauthor：ZHIFa-chao，Email，zfc@fimmu.com

ObjectiveTo study the influence of the small interfering RNA (siRNA) interference TMPRSS4 expression on human pancreatic cancer SW1990 cell′s proliferation and invasion.MethodsThe four eukaryotic expression vector of TMPRSS4 gene were synthesized in vitro and were transfected transiently into human pancreatic cancer SW1990 cells. TMPRSS4 mRNA expression of transfected cells was detected by real-time RT-PCR. The most efficient eukaryotic expression vector was used to be transfected into SW1990 cells. By using G418, cell strain that can silence TMPRSS4 gene stably was screened. The TMPRSS4 mRNA expression of the stable cell strain was detected by real time PCR TMPRSS4 protein expression was detected by western blot. The proliferation ability of transfected SW1990 cells was detected by CCK-8 method. By Transwell, the invasion change of SW1990 cell was detected.ResultsA stable cell strain, SW1990/psi TMPRSS4, was successfully constructed, in which the expression level of TMPRSS4 could be reduced stably by RNA interference. Cell transfection efficiency was 82.9%. Compared with the control group, the TMPRSS4 mRNA and protein levels were reduced by 80.1% and 60%,and number of penetrating cells was 118.6±13.4 in SW1990/psi TMPRSS4 group, which was significantly lower than those in the negative control group (157.4±12.9) and control group (157.0±9.5,P<0.01). Cells invasion inhibitory rate was 24.5% in SW1990/psi TMPRSS4 group. The cell proliferation was not significantly different among all the groups.ConclusionsA stable cell strain is screened successfully in which the expression level of TMPRSS4 can be reduced stably. The down-regulation of TMPRSS4 gene expression level can inhibit the invasion of SW1990 cells, but has no effect on cell proliferation.

Pancreatic neoplasms; Small interfering RNA; Gene silencing; TMPRSS4; SW1990 cell

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.012

510515 廣州，南方醫科大學南方醫院消化病研究所

智發朝，Email，zfc@fimmu.com