髓樣細胞表達激發受體-1對急性壞死性胰腺炎大鼠繼發感染的判斷價值

袁偉紅 徐岷 張尤歷 路箏 曹亮 李兆申

·論著·

髓樣細胞表達激發受體-1對急性壞死性胰腺炎大鼠繼發感染的判斷價值

袁偉紅 徐岷 張尤歷 路箏 曹亮 李兆申

目的探討髓樣細胞表達激發受體-1(TREM-1)在急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠繼發感染早期的表達變化及其判斷價值。方法24只雄性SD大鼠按數字表法隨機分為對照組、ANP組、ANP繼發感染 (SI)組。通過腹腔注射L-精氨酸、大腸桿菌建模。制模后24 h取血和腹水行細菌培養，測血清淀粉酶、C-反應蛋白(CRP)、TNF-α及TREM-1水平，胰腺組織常規病理檢查，實時PCR和蛋白質印跡法檢測胰腺組織TREM-1 mRNA和蛋白的表達。結果ANP組和SI組的胰腺病理評分、血清淀粉酶水平均明顯高于對照組，且SI組血和腹水細菌培養陽性率達100%，表明制模成功。SI組血CRP、TNF-α水平分別為(18.7±3.1)mg/L和(185.7±10.9)mg/L，與ANP組的(16.5±3.6)、(176.0±18.6)mg/L無顯著差異。SI組的血清TREM-1水平、胰腺組織TREM-1 mRNA及蛋白表達量分別為(9.3±0.9)ng/ml、14.84±3.45、316.2±59.2，均顯著高于ANP組的(5.5±0.3)ng/ml、4.51±1.44、188.6±42.4(P值均<0.05)。結論血清TREM-1水平對急性胰腺炎繼發感染早期具有一定的判斷價值。

胰腺炎，急性壞死性； 髓樣細胞表達激發受體-1； 繼發感染

目前普遍認為，繼發感染是引起重癥急性胰腺炎(SAP)后期高病死率的主要原因之一?，F臨床已通過C-反應蛋白(CRP)和TNF-α等來評判感染，但早期診斷價值非常有限。因此臨床急需找到敏感、特異、能即時反映感染過程的指標，以監測疾病進展，指導抗生素的應用。髓樣細胞表達激發受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)是在炎性反應觸發及放大過程中具有重要作用的一種蛋白。本實驗通過建立大鼠急性壞死性胰腺炎(ANP)及其繼發感染模型，檢測血清及胰腺組織TREM-1的表達，探討TREM-1對胰腺炎繼發感染的早期診斷價值。

材料和方法

一、實驗動物及分組

雄性SD大鼠24只，體重160～180 g，清潔級，購自浙江省實驗動物中心。按數字表法隨機分為對照組、ANP組、ANP繼發感染組(SI組)。采用20% L-精氨酸(國藥化學試劑有限公司)腹腔注射2.5 g/kg體重、共2次、間隔1 h的方法制備ANP模型。對照組腹腔注射等容積生理鹽水。SI組于末次L-精氨酸注射3 h后腹腔注射大腸桿菌DH5α 1.5 ml (菌液濃度約為108/ml),ANP組和對照組同時點注射等容積生理鹽水。術后24 h，剖腹取腹水及血行細菌培養，無腹水者采用3 ml無菌生理鹽水沖洗腹腔后收集沖洗液。另留取血清-20℃保存；取大鼠胰腺組織，部分用10%中性甲醛固定，部分置液氮凍存。

二、血清淀粉酶、TNF-α、CRP、TREM-1水平檢測

血清淀粉酶活性采用全自動生化分析儀測定。血清CRP、TNF-α及TREM-1采用ELISA方法檢測。TNF-α、CRP的ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司，TREM-1的ELISA檢測試劑盒購自美國GBD公司。按說明書操作。

三、胰腺組織病理學檢查

胰腺組織常規病理檢查。每張切片選取10個高倍鏡視野，參考Rongione等[1]標準從水腫、炎癥、出血、壞死4項進行評分，各項評分之和為最終得分。

四、實時PCR檢測胰腺組織TREM-1 mRNA表達

胰腺組織液氮研磨，采用Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)提取總RNA。采用Fermentas反轉錄試劑盒(立陶宛Fermentas公司)進行反轉錄。在美國Mx3000P Real-time PCR擴增儀進行擴增。依據NCBI公布的序列設計引物。TREM-1上游引物5′-GGTGACCAAGGGTTCTTC-3′，下游引物5′-GTA-TGTGGAGACACTCGTAG-3′，擴增片段196 bp；內參β-actin上游引物5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAAC-ACAGT-3′，下游引物5′-GACAGTGAGGCCAGGATA-GAG-3′，擴增片段182 bp。PCR反應條件：95℃ 20 s，58℃ 30 s，72℃ 15 s，40個循環。每個樣品重復檢測3次，采用相對定量法分析數據，將對照組表達量設為1，根據2-ΔΔCt公式計算基因相對表達倍數。

五、蛋白質印跡法檢測胰腺組織TREM-1蛋白表達

提取組織蛋白，常規行蛋白質印跡法。羊抗大鼠TREM-1抗體(Santa Cruz公司)1∶100稀釋，辣根過氧化物酶偶聯兔抗羊IgG抗體1∶5000稀釋，小鼠抗大鼠β-actin1∶500稀釋，辣根過氧化物酶耦聯山羊抗小鼠IgG抗體1∶4000稀釋。最后用ECL顯色。

六、統計學處理

結 果

一、胰腺組織病理變化

對照組大鼠胰腺無明顯改變。ANP組大鼠胰腺組織出血壞死，部分見血性腹水，光鏡示胰腺小葉輪廓破壞，間質水腫，血管充血，中性粒細胞和單核細胞浸潤。SI組大鼠胰腺組織可有皂化，伴大量血性腹水，腸管腫脹，光鏡示胰腺組織水腫、炎癥浸潤程度較ANP組嚴重，腺泡小葉結構明顯破壞，片狀脂肪壞死和出血。對照組、ANP組、SI組病理評分依次增加，各組間差異具有統計學意義(P值均<0.05，表1)。

二、血和腹水細菌培養結果

每只大鼠血和腹水的細菌培養結果一致。對照組均未培養出細菌；ANP組細菌陽性率為12.5%(1/8)，菌落克隆數量較少；SI組陽性率為100%(8/8)，菌落克隆數量多。培養的陽性菌種均為大腸桿菌。

三、血清淀粉酶、CRP、TNF-α及TREM-1水平變化

ANP組和SI組的血清淀粉酶、CRP、TNF-α及TREM-1水平均顯著高于對照組。SI組血淀粉酶、TREM-1水平較ANP組顯著升高(P值均<0.05)，而血CRP、TNF-α水平與ANP組無顯著差異(表1)。

表1 各組血清淀粉酶、CRP、TNF-α、TREM-1水平變化及胰腺病理評分

注：與對照組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

四、胰腺組織 TREM-1mRNA和蛋白表達變化

對照組、ANP組、SI組大鼠胰腺組織TREM-1 mRNA表達量分別為1.00、4.51±1.44、14.84±3.45，三組間差異均具有統計學意義(P值均<0.05)；TREM-1蛋白相對表達量分別為153.7±26.6、188.6±42.4、316.2±59.2，SI組較對照組及ANP組顯著增加(P值均<0.05，圖1)。

圖1各組胰腺組織TREM-1蛋白的表達(蛋白質印跡法)

討 論

TREM是Bouchon等[2]于2000年首次發現的表達于人類髓系細胞的一種活性受體，屬于免疫球蛋白超家族成員。當機體繼發感染時，TREM-1與其配體結合，促使單核細胞分泌炎性細胞因子，促使單核細胞和中性粒細胞表面多種細胞黏附分子表達增多，從而加快單核細胞和中性粒細胞向炎癥部位的遷移；并使包括CD40、CD86、CD54在內的共刺激分子以及單核細胞表面的CD83和CD32的表達大幅度增加，觸發及擴大細菌感染后細胞因子的級聯反應。因此TREM-1被認為在機體的急性過度炎癥反應過程中起著重要作用[3]。

本結果顯示，ANP組和SI組CRP、TNF-α及TREM-1水平均顯著高于對照組，但兩組間CRP、TNF-α水平無顯著差異，而SI組的TREM-1水平顯著高于ANP組。表明CRP、TNF-α在判斷早期繼發感染中的應用價值有限。進一步通過實時PCR和蛋白質印跡法證實SI組大鼠胰腺組織TREM-1mRNA和蛋白的表達量均顯著高于對照組，同時亦顯著高于ANP組，提示ANP早期繼發感染時TREM-1在mRNA及蛋白層面都有高表達，與Gibot等[4]、Yasuda等[5]、Kamei等[6]的結果一致，表明TREM-1對胰腺炎及其早期繼發感染具有一定的判斷價值，可能對抗生素的合理使用及手術時機的選擇具有一定的指導意義。

[1] Rongione AJ, Kusske AM, Kwan K, et al. Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in rat. Gastroenterology, 1997, 112:960-967.

[2] Bouchon A,Dietrich J,Colonna M.Cutting edge:inflammatory responses can be triggered by TREM-1,a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes.J Immunol,2000,164:4991-4995.

[3] Tang BM, Eslick GD, Craig JC, et al. Accuracy of procalcitonin for sepsis diagnosis in critically ill patients：systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis, 2007, 7:210-217.

[4] Gibot S, Cravoisy A, Kolopp-Sarda MN, et al. Time-course of sTREM(soluble triggering receptor expressed on myeloid cells)-1, procalcitonin, and C-reactive protein plasma concentrations during sepsis. Crit Care Med, 2005, 33:792-796.

[5] Yasuda T, Takeyama Y, Ueda T, et al. Increased levels of soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in patients with acute panereatitis. Crit Care Med, 2008, 36:2048-2053.

[6] Kamei K, Yasuda T, Ueda T, et al. Role of triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in experimental severe acute pancreatitis. J Hepatobiliary Pancreat Sci, 2010, 17:305-312.

2011-02-12)

(本文編輯：呂芳萍)

DiagnosticvalueofTREM-1insecondaryinfectionofacutenecrotizingpancreatitisofrat

YUANWei-hong,XUMin,ZHANGYou-li,LUZheng,CAOLiang,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China

Correspondingauthor:ZHANGYou-li,Email:zjyouli@yahoo.com.cn

ObjectiveTo detect the expression of triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1) in the early secondary infection of acute necrotizing pancreatitis (ANP) and to probe its diagnostic value for early infection.MethodsTwenty-four male SD rats were randomly divided into the control (C) group, the ANP group and the secondary infection of ANP (SIANP) group. The constructions of the models were achieved through intraperitoneal injection of L-arginine and E.coli. After 24 hours, the blood and peritoneal fluid samples were collected for bacterial culture, and the serum levels of amylase, CRP, TNF-α and TREM-1 were detected. The pathological changes in the pancreas were observed. The expression of TREM-1 mRNA and TREM-1 protein in pancreatic tissue was detected by Real-time PCR and Western Blot.ResultsThe histological score of pancreas, and serum amylase in ANP group and SIANP group were significantly higher than those in C group; the positive rate of bacterial culture of blood and peritoneal fluid in SIANP group was 100%, which suggested the model was successfully established. CRP and TNF-α levels in SIANP group were (8.7±3.1)mg/L and (185.7±10.9)mg/L, which were not significantly different from that in ANP group [(16.5±3.6), (176.0±18.6)mg/L]. The serum level of TREM-1, expression of TREM-1 mRNA and TREM-1 protein in pancreatic tissue was (9.3±0.9)ng/ml,14.84±3.45, 316.2±59.2, which were significantly higher than those in ANP group [(5.5±0.3)ng/ml, 4.51±1.44, 188.6±42.4,P<0.05].ConclusionsTREM-1 has diagnostic value for early secondary infection of ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Triggering receptor expressed on myeloid cells-1; Secondary infection

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.016

江蘇省自然科學基金(BK2009211)

212001 鎮江，江蘇鎮江江蘇大學附屬醫院消化科(袁偉紅、徐岷、張尤歷、曹亮)；第二軍醫大學長海醫院消化科(路箏、李兆申)

張尤歷，Email:zjyouli@yahoo.com.cn