高脂血癥對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺NF-κB活化及腺泡細胞凋亡的影響

孫娟 林志輝

·論著·

高脂血癥對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺NF-κB活化及腺泡細胞凋亡的影響

孫娟 林志輝

目的探討高脂血癥對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺組織病理損傷程度、NF-κB活化及胰腺腺泡細胞凋亡的影響。方法50只雄性SD大鼠隨機分成對照組、高脂血癥組(HL組)、ANP組 及HL+ANP組。對照組予均衡飼料喂養2周，僅開、關腹；HL組脂肪乳灌胃2周后開、關腹；ANP組予均衡飼料喂養2周后采用胰膽管注射牛磺膽酸鈉制備ANP模型；HL+ANP組在脂肪乳灌胃2周后制備ANP模型。免疫組化法檢測胰腺組織NF-κBp65及Fas、FasL蛋白表達，TUNEL法檢測胰腺腺泡細胞凋亡。結果HL組和HL+ANP組大鼠的血脂明顯升高。HL組胰腺見部分細胞有脂質空泡形成，中等量炎癥細胞浸潤；NF-κB活化輕度增強；凋亡蛋白Fas、FasL表達也有所增強；凋亡指數從(0.62±0.28)%增加到(3.35±1.12)%。ANP組胰腺大片壞死，大量炎癥細胞浸潤；大量腺胞細胞核有NF-κB p65表達；Fas與FasL表達亦明顯增強；凋亡指數為(2.20±1.78)%。HL+ANP組的胰腺壞死較ANP組更嚴重(3.4±0.7比2.4±1.1，P<0.05),NF-κB p65的表達陽性率及強度較ANP組更高；Fas與FasL的表達較ANP組有所減弱；凋亡指數為(0.93±0.87)%，較ANP組明顯降低(P<0.05)。結論高血脂能增強ANP大鼠胰腺NF-κB的活化，抑制腺泡細胞的凋亡，減少Fas與FasL的表達，加重胰腺組織壞死，故必須控制高血脂以減輕胰腺炎的損傷程度。

胰腺炎，急性壞死性； 高脂血癥; 核因子-κB; 細胞凋亡

高三酰甘油(hyperlipidemia, HL)血癥會導致或加重重癥急性胰腺炎(SAP)的發生，這一觀點已得到人們的廣泛認可，但其確切機制仍有待進一步研究。目前國內外大部分對HL與急性胰腺炎(AP)關系的研究僅局限于HL對AP的病情及胰腺組織病理損傷程度的影響。本實驗觀察HL對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺組織NF-κB活化及胰腺腺泡細胞凋亡的影響，為臨床治療提供實驗依據。

材料和方法

一、實驗動物及分組

50只雄性SD大鼠，清潔級，體重200～220 g，按數字表法隨機分成對照組、高脂血癥組(HL組)、ANP組 及HL+ANP組。前2組各10只，后2組各15只。應用自制脂肪乳劑每日1次灌胃、持續2周的方法建立大鼠高脂血癥模型；以胰膽管逆行注射3.5%牛磺膽酸鈉(Sigma公司)1 ml/kg體重的方法建立大鼠ANP模型。對照組予均衡飼料喂養2周，開腹輕翻胰腺后關腹；HL組予脂肪乳灌胃2周，開腹輕翻胰腺后關腹；ANP組經均衡飼料喂養2周后制備ANP模型；HL+ANP組在脂肪乳灌胃2周后制備ANP模型。

二、觀察指標

1．血三酰甘油、膽固醇、淀粉酶檢測：制模后6 h處死大鼠，腹主動脈采血，離心分離血清，由實驗診斷科常規檢測血三酰甘油、膽固醇、淀粉酶水平。

2．胰腺病理檢查：處死大鼠后觀察胰腺、腹腔等變化，取胰腺組織常規病理檢查，由病理科醫師盲法閱片，并根據Grewal等[1]標準對胰腺組織損傷進行定量評估。

3．胰腺組織NF-κB p65、Fas、FasL表達檢測：應

用免疫組化二步法檢測胰腺組織NF-κB p65、Fas、FasL表達。兔抗鼠NF-κB p65、Fas、FasL多抗均購自美國Santa Cruze公司。免疫組化試劑盒購自北京中杉公司，按說明書操作。細胞表達強度判斷：“-”未著色，“+”淺黃色，“++”黃色，“+++”棕黃色。每張切片高倍鏡下隨機觀察100個細胞，共4個視野，計算陽性細胞占總細胞的百分率，取均值。

4．胰腺腺泡細胞凋亡檢測：應用TUNEL法檢測。試劑盒購自美國Roche公司，按說明書操作。每張切片隨機選取5個凋亡細胞數最多的高倍視野，計算500個腺泡細胞中凋亡細胞所占的百分比為凋亡指數(AI)。

三、統計學處理

結 果

一、大鼠血三酰甘油、膽固醇及淀粉酶水平

HL組大鼠血三酰甘油、膽固醇水平均較對照組明顯升高，淀粉酶水平與對照組無顯著差異。ANP組血三酰甘油、淀粉酶水平較對照組明顯升高(P值均<0.01)，但膽固醇水平與對照組無顯著差異。HL+ANP組血甘油三酯、膽固醇、淀粉酶水平均較對照組明顯升高(P值均<0.01)；三酰甘油水平較HL組明顯下降，膽固醇較HL組明顯升高(P值均<0.01);膽固醇水平較ANP組明顯升高，淀粉酶水平較ANP組明顯下降(P值均<0.01，表1)。

表1 各組大鼠血清三酰甘油、膽固醇及淀粉酶水平

注：與對照組比較，aP<0.01；與HL組比較，bP<0.01；與ANP組比較，cP<0.01

二、胰腺組織病理改變

對照組胰腺組織無明顯病理改變。HL組肉眼觀察未見異常；鏡下見部分細胞有脂質空泡形成，中等量炎癥細胞浸潤，未見明顯出血及壞死。ANP組與HL+ANP組肉眼均見腹腔內大量血性腹水，胰腺呈現體積增大、包膜緊張、表面顯著充血、切面見出血和壞死等改變；ANP組鏡下見葉間隙及腺泡間隔顯著擴張，大量炎癥細胞浸潤及較多紅細胞，有面積不等的腺細胞壞死；HL+ANP組同樣出現水腫、炎癥細胞浸潤、出血、壞死等改變，尤以壞死更為嚴重。各組胰腺組織病理評分見表2。

表2 各組胰腺組織病理損傷評分

注：與對照組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.05

三、胰腺組織NF-κB p65、Fas、FasL表達

對照組胰腺組織幾乎無NF-κB p65的表達。HL組胰腺僅見少數腺泡細胞核中NF-κB p65表達，偶見胞質表達，陽性表達率與對照組相當，但表達強度略高于對照組。ANP組與HL+ANP組均見大量腺胞細胞核中NF-κB p65表達，胞質中也有表達，表達陽性率及強度均高于對照組，且HL+ANP組NF-κB p65表達陽性率及強度更高(表3，圖1)。

表3 各組胰腺組織NF-κB p65的表達陽性率及強度(只)

注：各組兩兩比較，P值均<0.05

圖1ANP組(a)、HL+ANP組(b)大鼠胰腺組織NF-κB p65表達(免疫組化 ×400)

對照組胰腺幾乎無Fas表達。HL組胰腺Fas弱陽性表達，部分胞質染成淺黃色。對照組與HL組胰腺均有FasL表達，幾乎所有胞質均被染成淺黃色，也有少量胞膜著色。ANP組胰腺Fas與FasL的表達均較對照組明顯增強，以炎癥浸潤區和壞死區最為顯著。HL+ANP組胰腺Fas與FasL的表達較ANP組有所減弱(圖2)。

圖2ANP組(左列)、HL+ANP組(右列)大鼠胰腺組織Fas(上)表達、FasL(下)表達(免疫組化 ×400)

四、胰腺腺泡細胞凋亡指數

對照組、HL組、ANP組、HL+ANP組胰腺腺泡細胞AI分別為(0.62±0.28)%、(3.35±1.12)%、(2.20±1.78)%、(0.93±0.87)%。HL組和ANP組胰腺腺泡AI均較對照組明顯升高；而HL+ANP組AI較ANP組下降(圖3)。

討 論

近年來， 對NF-κB在AP尤其是SAP中作用的研究已取得重大進展[2-3]。我們的實驗發現，發生ANP的兩組大鼠中NF-κBp65的表達陽性率和強度都比對照組明顯增強，這與國內外研究結果相同。我們的研究還發現，HL大鼠發生ANP時，其胰腺組織中NF-κBp65比血脂正常的大鼠表達增強，這可能是HL大鼠發生ANP時胰腺組織壞死更為嚴重的原因之一。

圖3ANP組(a)、HL+ANP組(b)大鼠胰腺腺泡細胞凋亡(TUNEL ×400)

本實驗結果顯示，對照組胰腺組織中偶見腺泡細胞發生凋亡，其Fas與FasL的表達呈陰性或弱陽性，在發生ANP后，胰腺腺泡細胞的凋亡指數顯著升高，Fas與FasL的表達也顯著增強。而HL+ANP組的腺泡細胞凋亡指數較ANP組降低，Fas與FasL的表達強度也明顯減弱，表明與正常的大鼠相比，HL大鼠發生ANP時腺泡細胞凋亡較少，這可能是HL大鼠發生ANP時胰腺組織壞死更為嚴重的又一原因。

另外，本實驗顯示，HL+ANP組大鼠胰腺病理損傷中，水腫、炎癥、出血評分和ANP組比較沒有顯著性差異，但壞死的評分顯著增高，說明HL大鼠發生ANP時胰腺壞死程度比血脂正常的大鼠嚴重，這與Kimura等[4]、Hofbauer等[5]和尤和誼等[6]的研究結果相符。本結果還顯示，ANP大鼠的血三酰甘油水平比正常大鼠明顯升高，提示不但血三酰甘油水平升高可加重ANP，ANP也會引起血三酰甘油水平的升高，二者互相影響，互為因果，造成惡性循環。

本實驗HL+ANP組大鼠的血清淀粉酶水平較ANP組的降低。這種現象在臨床上也有發現，約有50%的HL性AP患者的血、尿淀粉酶水平正常或只是稍高于正常水平，這給診斷帶來了一定的困難[7]。其原因可能是由于這類患者的血漿中存在一種抑制血淀粉酶活性的因子，這種非脂類抑制因子還能通過腎臟進入尿液，抑制尿淀粉酶的活性。當然也不排除由于胰腺損傷太嚴重導致血清淀粉酶反而下降的可能。

Hofbauer等[5]的動物實驗顯示單純高三酰甘油血癥組大鼠的胰腺存在輕度水腫。而本實驗顯示，HL組大鼠胰腺組織的水腫程度與對照組無顯著性差異，但炎癥評分顯著增高。免疫組化結果還顯示，HL組大鼠的胰腺組織中NF-κB p65的表達陽性率較對照組雖然沒有顯著性差異，但表達強度卻明顯增強。另外，用TUNEL測定其腺泡細胞凋亡指數也顯著增高，凋亡調控蛋白Fas、FasL的表達也相應增強。表明血脂增高的大鼠的胰腺組織中已有NF-κB的活化，可引起輕度炎癥反應，同時啟動腺泡細胞凋亡這一機體自我保護機制來抑制和局限炎癥反應。但隨著血脂升高，血漿中游離脂肪酸進一步增多，血粘度升高，血栓素A2/前列腺素I2失衡加重，各種因素刺激NF-κB大量活化，引起炎癥介質瀑布樣激活，導致炎癥失控，發生AP甚至SAP，因此HL可加重或引起AP的發生。

[1] Grewal HP,Moheyel Din A,Gaber L,et al.Amelioration of the physiologic and biochemical changes of acute pancreatitis using an anti-TNF-alpha polyclonal antibody.Am J Surg,1994,167:214-219.

[2] Gukovsky I,Gukovskaya AS,Blinman TA,et al.Early NF-kappaB activation is associated with hormone induced pancreatitis.Am J Physiol,1998,275:G1402-G1414.

[3] Altavilla D,Famulari C,Passaniti M,et al.Attenuated cerulein-induced pancreatitis in nuclear factor-kappaB-deficient mice.Lab Invest,2003,83:1723-1732.

[4] Kimura W,Mossner J.Role of hypertriglyceridemia in the pathogenesis of experimental acute pancr eatitis in rats.Int J Pacreatol,1996,20:177-184.

[5] Hofbauer B,Friess H,Weber A,et al.Hyperlipaemia intensifies the course of acute oedematous and acute necrotising pancreatitis in the rat.Gut,1996,38:753-758.

[6] 尤和誼，蔡端.高脂血癥對大鼠急性胰腺炎發生的影響.肝膽胰外科雜志，2005,17:26-28.

[7] Yadav D,Pitchumoni CS.Issues in hyperlipidemic pancreatitis.Clin J Gastroenterol,2003,36: 54-62.

2010-06-07)

(本文編輯：屠振興)

ActivationofNF-κBandacinarcellapoptosisinhyperlipidemicratswithsevereacutepancreatitis

SUNJuan，LINZhi-hui.

DepartmentofGastroenterology,FuzhouFirstHospital,Fuzhou350009,China

Correspondingauthor:LINZhi-hui,Email:wind8864gy@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of hyperlipidemia (HL) on the pancreatic injuries during acute necrotizing pancreatitis (ANP) as well as the activation of nuclear factor kappa B (NF-κB) and pancreatic acinar cell apoptosis.MethodsFifty SD male rats were randomly divided into control group, hyperlipidemia (HL) group, ANP group and HL+ANP group. Rats in control group were fed with balanced diet for 2 weeks, and underwent opening and closing of the abdomen. Rats in HL group

fat emulsion lavage, and then underwent opening and closing of the abdomen. Rats in ANP group were fed with balanced diet for 2 weeks, and were induced by retrograde injection of sodium taurocholate into the bili-pancreatic duct to establish the ANP model. Rats in HL+ANP group received fat emulsion lavage for 2 weeks, and were induced by retrograde injection of sodium taurocholate into the bili-pancreatic duct to establish the ANP model. NF-κB p65 and Fas, FasL protein expression were determined by immunohistochemical method and the apoptosis in pancreatic acinar cell were detected by TUNEL.ResultsTwo weeks after fat emulsion lavage, rats in HL and HL+ANP group had significantly higher serum level of lipid. Lipid vacuoles were present in some pancreatic cells in the rats of HL group, and middle number of inflammatory cells infiltration was found, the activation of NF-κB was slightly enhanced; and the expression of Fas, FasL was also enhanced. Apoptosis index increased from (0.62±0.28)% to (3.35±1.12)%. Massive pancreatic tissue necrosis, large amount of inflammatory cells infiltration was found in ANP group. NF-κB p65 was present in large number of pancreatic nucleus. The expression of Fas and FasL was also increased; the apoptosis index was (2.20±1.78)%. The degree of pancreatic necrosis was greater in HL+ANP group than that in ANP group (3.4±0.7vs. 2.4±1.1,P<0.05). The positive rate and density of NF-κB expression was higher than that in ANP group; and the expression of Fas and FasL was decreased more than that in ANP group; the apoptosis index was (0.93±0.87)%, which was significantly lower than that in ANP group (P<0.05).ConclusionsHigh level of lipid can increase the activation of NF-κB and inhibit the acinar cell apoptosis, and decrease the expression of Fas and FasL, increase the pancreatic tissue necrosis, therefore in order to attenuate the injury of pancreas, it is essential to control blood lipid.

Pancreatitis,acute necrotizing; Hyperlipidemia; NF-κB; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.019

350009 福州，福建福州市第一醫院消化內科(孫娟)；福建省立醫院消化內科(林志輝)

林志輝，Email:wind8864gy@163.com