內分泌腺來源的血管內皮生長因子抑制胰腺癌細胞凋亡的信號轉導機制研究

任麗楠 郭曉鐘 鄒德莉 劉峰

·論著·

內分泌腺來源的血管內皮生長因子抑制胰腺癌細胞凋亡的信號轉導機制研究

任麗楠 郭曉鐘 鄒德莉 劉峰

目的探討內分泌腺來源的血管內皮生長因子(EG-VEGF)在胰腺癌MiaPaCa細胞中抗凋亡作用及其相關分子機制。方法以50、100、200 ng/ml EG-VEGF處理細胞，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡，蛋白質印跡法檢測細胞p42/44MAPK、STAT3蛋白表達及其磷酸化，檢測抗凋亡蛋白Mcl-1的表達。應用G蛋白耦聯非特異受體阻斷劑PTX、Rsa/ERK信號通路阻斷劑PD98059和JAK/STAT3信號通路阻斷劑AG490預處理細胞1 h，觀察Mcl-1蛋白表達的變化。結果100 ng/ml EG-VEGF可使MiaPaCa細胞的凋亡率從(28.4±4.6)%顯著下降到(13.2±2.5)%(P<0.05)。50 ng/ml的EG-VEGF處理后，MiaPaCaⅡ細胞p42/44MAPK的磷酸化增加(1.735±0.019)倍；STAT3的磷酸化增加(21.810±0.052)倍，均較對照組顯著增加(P值均<0.05),但100、200 ng/ml EG-VEGF沒有進一步增加蛋白的磷酸化。50 ng/ml的EG-VEGF處理后，Mcl-1蛋白的表達較對照組增加(3.460±0.002)倍，但100、200 ng/ml EG-VEGF沒有進一步增加蛋白的表達；應用PTX預處理后，Mcl-1蛋白表達的增加被完全抑制，用PD98059、AG490預處理后Mcl-1表達增加抑制率分別為52%和68%。結論EG-VEGF可抑制MiaPaCa細胞的凋亡，其機制可能與激活Ras-MAPK和JAK-STAT3信號轉導通路及增加Mcl-1蛋白的表達有關。

胰腺腫瘤； 血管內皮生長因子； 細胞凋亡； 信號轉導

內分泌腺來源的血管內皮細胞生長因子(endocrine glands-derived vascular endothelial growth factor，EG-VEGF，又稱 PK1)是近年來發現的具有組織特異性的血管內皮生長因子。它可調控腫瘤細胞的多種生物學功能，但對胰腺癌的調控作用目前尚無文獻報道。本實驗旨在觀察EG-VEGF對人胰腺癌細胞株MiaPaCa Ⅱ細胞凋亡的影響，探討其相關信號轉導的分子機制。

材料和方法

一、流式細胞儀檢測細胞凋亡

人胰腺癌高轉移細胞系MiaPaCa Ⅱ由瑞士伯爾尼大學Friess博士惠贈。細胞接種于6孔板，常規培養。待細胞貼壁后將培養基換成無血清DMEM培養過夜，培養上清中加入終濃度為100 ng/ml的重組人EG-VEGF(Peprotech公司)，對照組上清不加EG-VEGF，每組設3個復孔。繼續培養24 h后加入AnnexinⅤ-PI(BD PharMingen)染色，流式細胞儀檢測凋亡率。

二、蛋白質印跡法檢測p42/44MAPK、磷酸化p42/44MAPK (P-p42/44MAPK)、STAT3、P-STAT3及Mcl-1蛋白表達

MiaPaCa Ⅱ細胞貼壁后用無血清DMEM培養過夜的細胞培養上清中加入終濃度為50、100、200 ng/ml的EG-VEGF，以不加EG-VEGF細胞作為對照，繼續培養20 min。收集細胞，提取細胞總蛋白，應用蛋白質印跡法檢測p42/44MAPK、P-p42/44MAPK、STAT3、P-STAT-3蛋白表達。鼠抗人p42/44MAPK、P-p42/44MAPK、STAT3、P-STAT-3一抗(均購自Cell Signaling公司)以及內參抗β-actin一抗(Santa Cruz Biotechnology公司)均1∶1000稀釋；鼠抗人Mcl-1(R&D Systems公司)一抗以1∶500稀釋；辣根過氧化物酶標記的二抗(北京中山生物有限公司)1∶5000稀釋。最后ECL發光，圖像掃描儀掃描。以目的條帶與β-actin條帶灰度比值表示蛋白相對表達量。以對照組的磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白比值作為1，計算實驗組的磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白比值的增加倍數。

此外，在無血清DMEM培養過夜的MiaPaCaⅡ細胞培養基中分別加入G蛋白耦聯非特異受體阻斷劑PTX(終濃度為 200 ng/ml，公司)、Rsa/ERK信號通路阻斷劑PD98059(終濃度為50 μmol/L)和JAK/STAT3信號通路阻斷劑AG490 (終濃度為100 μmol/L)預處理細胞1 h，以單加DMSO為DMSO組。隨后吸盡培養上清，加入終濃度為100 ng/ml EG-VEGF的培養基繼續培養 2 h，以不加EG-VEGF為對照組。應用蛋白質印跡法檢測處理前后細胞的Mcl-1蛋白表達。以目的條帶與β-actin條帶灰度比值表示蛋白的相對表達量，以對照組為1，計算實驗組Mcl-1蛋白表達的增加倍數。

三、統計學分析

實驗數據用SPSS11.0軟件包，兩組均數間比較采用t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、EG-VEGF對MiaPaCaⅡ細胞凋亡的影響

AnnexinⅤ-PI染色后，單綠色著色為早期凋亡細胞，單紅色為晚期凋亡細胞，紅色和綠色共同著色為凋亡中期細胞(圖1)。對照組的細胞凋亡率為(28.4±4.6)%，100 ng/ml EG-VEGF處理組的細胞凋亡率為(13.2±2.5)%，較對照組顯著降低(P<0.05)。

圖1 MiaPaCaⅡ細胞的凋亡狀況(AnnexinⅤ-PI染色)

二、EG-VEGF對細胞p42/44MAPK、STAT3磷酸化的影響

50、100、200 ng/ml的EG-VEGF處理后，MiaPaCaⅡ細胞p42/44MAPK的磷酸化分別增加(1.735±0.019)、(1.943±0.022)、(1.930±0.054)倍； STAT3的磷酸化分別增加(21.810±0.052)、(28.850±0.048)、(28.870±0.054)倍(圖2a、b)，但各濃度間增加磷酸化的程度無顯著差異。

三、EG-VEGF對細胞Mcl-1 蛋白表達的影響

50、100、200 ng/ml的EG-VEGF處理后，MiaPaCaⅡ細胞Mcl-1的表達量較對照組分別增加(3.460±0.002)、(3.900±0.002)、(3.940±0.003)倍(圖2c)。但各濃度間表達的增加程度無顯著差異。

圖2不同濃度EG-VEGF對細胞p42/44MAPK(a)、STAT3(b)磷酸化及Mcl-1蛋白表達(c)的影響

四、相關信號轉導通路阻斷劑對細胞Mcl-1表達的影響

DMSO組、PTX組、PD98059組、AG490組的Mcl-1蛋白表達量較對照組分別增加(2.320±0.005)、(0.940±0.003)、(1.870±0.006)、(1.250±0.005)倍。PTX完全阻斷EG-VEGF對Mcl-1表達的增強作用，而PD98059及AG490阻斷EG-VEGF對Mcl-1表達的增強作用分別為52%和68%(圖3)。

圖3 相關信號通號阻斷劑對Mcl-1蛋白表達的影響

討 論

EG-VEGF(PK1)是2001年被確認的組織特異性的血管內皮生長因子[1]，僅僅作用于生成類固醇組織的細胞。它有兩個G蛋白耦聯受體PKR1和PKR2[2]，與受體結合后激活絲裂酶原活化蛋白酶p42/44和磷脂酰肌醇3-激酶信號通路，導致內皮細胞增殖、遷移和存活[3]。但對其調控胰腺癌細胞凋亡的作用及機制目前尚無相關報道。

本結果顯示， EG-VEGF能抑制MiaPaCa Ⅱ細胞的凋亡，可促進p42/44MAPK的磷酸化，激活Ras-MAPK信號通路，與文獻報道相一致[3-4]。同時，本結果顯示，EG-VEGF可促進STAT3的磷酸化，激活JAK-STAT3信號通路。有關研究尚未見有類似的報道。

Mcl-1是Bcl-2家族中重要的抗凋亡蛋白，在胰腺癌凋亡的過程中扮演重要作用[5]。本結果顯示，一定劑量的EG-VEGF可促進Mcl-1的表達，應用PTX可相對完全地阻斷EG-VEGF對Mcl-1的調控作用，這是因為PTX阻斷了EG-VEGF與受體的結合所致[6]。這一結果一方面提示EG-VEGF對Mcl-1的調控關系，另一方面也反映其可在胰腺癌細胞中激活相關信號轉導通路，上調抗凋亡蛋白的表達。由于EG-VEGF的組織特異性，故其在胰腺癌的研究中有可能成為診斷和治療的新靶點。

[1] LeCouter J, Kowalski J, Foster J, et al. Identification of an angiogenic mitogen selective for endocrine gland endothelium. Nature, 2001,412:877-884.

[2] Lecouter J, Ferrara N.EG-VEGF and Bv8. A novel family of tissue-selectivemediators of angiogenesis, endothelial phenotype and function. Trends Cardiovas Med,2003, 13: 276-282.

[3] Kisliouk T, Podlovni H, Spanel BK. Prokineticins (endocrine gland-derived vascular endothelial growth factor and BV8) in the bovine ovary: expression and role as mitogens and survival factors for corpus luteum-derived endothelial cells. Endocrinology, 2005, 146: 3950-3958.

[4] Lin R, LeCouter J, Kowalski J, et al. Characterization of endocrine gland-derived vascular endothelial growth factor signaling in adrenal cortex capillary endothelial cells. J Biol Chem,2002,277:8724-8729.

[5] Akgul C, Turner PC, White MR, et al. Functional analysis of the human MCL-1 gene. Cell Mol Life Sci,2000, 57: 684-691.

[6] Lin DC,Bullock CM,Ehiert FJ,et al.Identification and molecular characterization of two closely related G protein-coupled receptors activated by prokineticins/endocrine gland vascular endothelial growth factor. J Biol Chem,2002, 277: 19276-19280.

2010-11-02)

(本文編輯：屠振興)

InvestigationofthesignaltransductioninEG-VEGFinhibitingpancreaticcancercellsfromapoptosis

RENLi-nan,GUOXiao-zhong,ZOUDe-li,LIUFeng.

GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommend,Shenyang110840,China

Correspondingauthor:GUOXiao-zhong,Email:guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the anti-apoptosis effects of EG-VEGF on pancreatic cancer cell MiaPaCa and its molecular mechanism.MethodsThe cells were treated with 50, 100, 200 ng/ml EG-VEGF. Flow cytometry was used to determine the apoptosis. The expression of p42/44MAPK, STAT3 protein and the phosphorylation, and anti-apoptosis protein Mcl-1 was evaluated by Western blot. Non-specific G protein-coupled receptor antagonist PTX, Rsa/ERK signal transduction blockade PD98059, JAK/STAT3 signal transduction blockade AG490 were used to treat the cells for 1 h, and the change of Mcl-1 protein was observed.ResultsAfter treated with 50 ng/ml EG-VEGF, the apoptosis rate of MiaPaCa was decreased from (28.4±4.6)% to (13.21±4.65)% (P<0.05); the phosphorylation of p42/44MAPK increased by 1.735±0.019 folds; the phosphorylation of STAT3 increased by 21.810±0.052 folds; the expression of Mcl-1 protein increased by 3.460±0.002 folds when compared with that of control group,and the difference was statistically significant (P<0.05). But the degree of phosphorylation and the expression of Mcl-1 were not further increased with 100, 200 ng/ml EG VEGF treatment. After PTX pre-treatment, the increase of Mcl-1 protein expression was completely inhibited, and after PD98059, AG490 pre-treatment, the increase of Mcl-1 expression was inhibited to 52% and 68%.ConclusionsEG-VEGF can inhibit MiaPaCa cell from apoptosis, and the mechanism may be related with activation of Ras MAPK and JAK STAT3 signal transduction pathway and up-regulation of Mcl-1.

Pancreatic neoplasm; Vascular endothelial growth factor; Apoptosis; Signal transduction

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.015

110840 沈陽，沈陽軍區總醫院消化內科

郭曉鐘，Email:guoxiaozhong1962@163.com