丙戊酸鈉對人胰腺癌細胞PaTu8988增殖的影響及量效關系研究

高飛 徐岷 麻樹人 張寧 蔣小猛 徐萍

·論著·

丙戊酸鈉對人胰腺癌細胞PaTu8988增殖的影響及量效關系研究

高飛 徐岷 麻樹人 張寧 蔣小猛 徐萍

目的探討丙戊酸鈉(VPA)對人胰腺癌PaTu8988細胞增殖和細胞周期的影響。方法應用0.2、1.0、5.0 mmol/L的VPA干預人胰腺癌PaTu8988細胞24、48 h，采用WST-8法檢測細胞存活率，流式細胞儀檢測細胞周期。以培養基中單加二甲基亞砜為空白對照組，單加PBS為PBS組。結果VPA干預24 h后，VPA 5.0 mmol/L組的細胞生長抑制率為18.9%，顯著高于對照組、PBS組及VPA 0.2、1.0 mmol/L組(0、4.4%、6.8%、6.1%，P值均<0.05)；干預48 h后，VPA 1.0、5.0 mmol/L組的細胞生長抑制率分別為12.9%、25.9%，顯著高于對照組、PBS組、VPA 0.2 mmol/L組(0、6.2%、4.6%，P值均<0.01)。VPA干預24 h后，VPA 1.0、5.0 mmol/L組G2期細胞比例分別為(26.57±1.88)%、(34.11±4.74)%，顯著高于PBS組、對照組、VPA 0.2 mmol/L組[(10.72±2.02)%、(13.53±2.28)%、(13.81±2.40)%，P值均<0.01]；VPA干預48 h后的細胞周期變化與24 h一致。結論VPA呈時間及劑量依賴性抑制人胰腺癌PaTu8988細胞的增殖，誘導細胞阻滯在G2期。

胰腺腫瘤； 丙戊酸鈉； 乙酰化作用； 細胞增殖； 細胞周期

組蛋白乙酰化在哺乳動物發育及腫瘤發生、發展過程中發揮重要作用。核小體組蛋白的乙酰化狀態由組蛋白乙酰化酶(histone acetyl transferase, HAT)與組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)活性的平衡所控制，這種平衡的打破成為產生某些癌癥的直接誘因。丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)是一種廣譜抗癲癇藥物。新近研究顯示，VPA也是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACI)，可誘導多種腫瘤細胞分化與凋亡[1]。它對胰腺癌細胞的作用國內尚未見報道。本研究觀察VPA對人胰腺癌細胞PaTu8988增殖及細胞周期的影響，探討其機制。

材料和方法

一、細胞培養及分組

人胰腺癌PaTu8988細胞系由德國Marburg市Philipps大學細胞生物學和分子病理學研究所Elsasser博士惠贈。收集對數生長期PaTu8988細胞，按1×104個/孔接種于96孔板。分為對照組、PBS組及VPA 0.2、1.0、5.0 mmol/L組。對照組細胞培養基中僅加入等容積二甲基亞砜，PBS組細胞培養基中僅加PBS。每組3個復孔。培養48、72 h。

二、細胞存活率檢測

按上述分組培養細胞48、72 h后，每孔加入10 μl WST-8試劑(日本株式會社同仁化學研究所)，再培養4 h。在酶聯免疫儀上測450 nm波長的吸光度(A450)值，參比波長為630 nm。以含等容積二甲基亞砜的培養基調零。細胞存活率= (實驗孔A450值/對照孔A450值)×100%。

三、細胞周期檢測

收集上述培養的各組細胞，用預冷PBS洗滌細胞2次，加入預冷70%乙醇4℃固定過夜。加入100 μg/ml的RNase 10 μl，50 μg/ml的碘化丙啶緩沖液300 μl，4℃避光孵育30 min，流式細胞儀(FACS Calibur，美國Becton Dickinson公司)檢測細胞周期。

四、統計學處理

結 果

一、VPA對胰腺癌PaTu8988細胞增殖的影響

干預24 h后，對照組、PBS組及VPA 0.2、1.0、5.0 mmol/L組的A450值分別為1.000±0.023、0.956±0.070、0.932±0.101、0.939±0.089、0.811±0.131；細胞生長抑制率分別為0、4.4%、6.8%、6.1%、18.9%。VPA 5.0 mmol/L組的細胞生長抑制率顯著高于其他4組(P值均<0.05)，而其他4組間的差異無統計學意義。

干預48 h后，對照組、PBS組及VPA 0.2、1.0、5.0 mmol/L組的A450值分別為2.793±0.144、2.620±0.053、2.663±0.078、2.432±0.084、2.068±0.178；細胞生長抑制率分別為0、6.2%、4.6%、12.9%、25.9%。VPA 1.0、5.0 mmol/L組的細胞生長抑制率顯著高于對照組、PBS組、VPA 0.2 mmol/L組(P值均<0.01)，而VPA 0.2 mmol/L組與PBS組、對照組之間差異無統計學意義。VPA呈劑量及時間依賴性抑制PaTu8988細胞的增殖。

二、VPA對胰腺癌PaTu8988細胞周期的影響

VPA干預后，VPA 1.0、5.0 mmol/L組G1期和S期細胞比例較對照組、PBS組及VPA 0.2 mmol/L組顯著減少，而G2期細胞比例顯著增加(P<0.05或<0.01，表1)。

表1 VPA干預24、48 h后胰腺癌細胞PaTu8988細胞周期的變化

注：與對照組、PBS組比較，aP<0.05；bP<0.01

討 論

表觀遺傳學(epigenetics)是通過DNA自身化學修飾方式從轉錄水平影響基因表達的，它主要包括組蛋白乙酰化修飾和DNA甲基化等[2]。核小體作為哺乳動物細胞染色質的基本組成單位，其核心由146 bp的DNA圍繞一個由H2A、H2B、H3和H4各兩個拷貝組蛋白構成的八聚體組成。核小體組蛋白可通過乙酰化和脫乙酰化來改變染色體的結構，也可以影響轉錄因子與DNA序列的結合，對基因表達調控具有類似DNA遺傳密碼的作用[3]。組蛋白乙酰化及去乙酰化修飾由HAT和HDAC調控，而組蛋白去乙酰化所表現的基因轉錄沉默與多種腫瘤的發生、發展有密切的關聯[4]。HDACI能促使腫瘤細胞產生不同程度的分化、凋亡以及細胞周期的變化；可抑制腫瘤血管形成；可增強腫瘤細胞對放、化療的敏感性[5]。所以HDACI導致的組蛋白高乙酰化狀態在抗腫瘤中的作用日益受到重視[6]。

VPA類屬羧酸，是一種含有8個碳原子的短鏈脂肪酸，目前廣泛應用于抗癲癇及雙相性精神障礙的臨床治療。近期研究證實，VPA是HDACs特異性抑制劑之一。據文獻報道[7]，VPA在體外能夠抑制血液系統和神經系統腫瘤細胞的增殖。新近研究發現[8-10]，VPA對實體性腫瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌等同樣具有抑制腫瘤細胞增殖的作用。但對胰腺癌細胞的作用，目前尚未見報道。

本研究結果表明，VPA干預人胰腺癌PaTu8988細胞24、48 h后，細胞生長不同程度地被抑制，抑制率在4.6%～25.9%，且呈濃度和時間依賴性，VPA 1.0、5.0 mmol/L組對人胰腺癌PaTu8988細胞增殖抑制作用更顯著。同時，VPA 1.0、5.0 mmol/L組的G1期及S期細胞比例明顯減少，G2期細胞比例顯著增多，即發生G2期細胞周期阻滯。VPA對細胞周期的阻滯作用可能由于組蛋白乙酰化及去乙酰化狀態的改變導致染色質的局部重塑及DNA纏繞的核小體動態改變，從而影響了負責細胞周期調控的基因轉錄改變[11]。有研究表明，VPA對腫瘤細胞周期的阻滯作用主要發生在G1期，可能與p21WAF/CIPI表達增加有關。p21WAF/CIPI是體內的重要CDK抑制劑，能使Rb、p107、p130蛋白去磷酸化，抑制細胞生長，使細胞周期停滯在G1期[7]。本研究結果顯示，VPA對PaTu8988細胞周期的阻滯作用主要發生在G2期。VPA對不同種類細胞周期抑制的不同，有待我們下一步深入研究。

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2011-03-01)

(本文編輯：屠振興)

EffectofvalproicacidontheproliferationofhumanpancreaticcancercellPaTu8988anddose-effectrelationship

GAOFei,XUMin,MAShu-ren,ZHANGNing,JIANGXiao-meng,XUPing.

DepartmentofDigestiveEndoscopy,GeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang110840,China

Correspondingauthor:MAShu-ren,Email：shuren_ma@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of valproic acid (VPA) on cell proliferation and cell cycle in human pancreatic cancer cell line PaTu8988 in vitro.MethodsPaTu8988 cells were treated with VPA in concentration of 0, 0.2, 1.0 or 5.0 mmol/L for 24 h and 48 h respectively. Cell viability was measured by WST-8 assay. Cell cycles were detected by flow cytometery. Dimethyl sulfoxide added to the medium was used as blank control group, while PBS added to the medium was used as PBS group.ResultsAfter VPA treatment for 24 h, the inhibition rate of VPA 5.0 mmol/L group was 18.9%, which was significantly higher than those in control group,PBS group and VPA 0.2, 1.0 mmol/L group (0, 4.4%, 6.8%, 6.1%,P<0.05). After 48 h, the inhibition rates of VPA 1.0, 5.0 mmol/L were 12.9%, 25.9%, which was significantly higher than those in control group, PBS group and VPA 0.2 mmol/L group (0, 6.2%, 4.6%,P<0.01). After VPA treatment for 24 h, the proportions of G2 phase cell in VPA 1.0, 5.0 mmol/L group were (26.57±1.88)%, (34.11±4.74)%, which was significantly higher than those in PBS group, control group, VPA 0.2 mmol/L group [(10.72±2.02)%, (13.53±2.28)%, (13.81±2.40)%,P<0.01], the changes 48 h after VPA treatment was consistent with the changes 24 h after VPA treatment.ConclusionsVPA may significantly suppress the cell proliferation of human pancreatic cancer cell line PaTu8988, and induce cell cycle arrest in G2 phase in a time and dose-dependent manner.

Pancreatic neoplasm; Valproic acid; Acetylation; Cell proliferation; Cell cycle

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.009

沈陽軍區總醫院科研基金(09Y-Z02)

110840 沈陽，沈陽軍區總醫院內窺鏡科(高飛、麻樹人、張寧)；江蘇大學附屬醫院消化科(徐岷、蔣小猛、徐萍)

麻樹人，Email:shuren_ma@163.com