褪黑素對急性壞死性胰腺炎合并腎損傷的保護作用及機制研究

楊慧瑩 唐國都 蘇娟 覃蒙斌 梁志海 鐘衛一

褪黑素對急性壞死性胰腺炎合并腎損傷的保護作用及機制研究

楊慧瑩 唐國都 蘇娟 覃蒙斌 梁志海 鐘衛一

急性腎功能衰竭是重癥急性胰腺炎(SAP)患者早期病死的主要原因之一。因此研究其發病機制并尋求有效的防治措施具有重要的臨床價值。Ghrelin是生長激素促分泌物受體的內源性配體，它在急性胰腺炎(AP)發生發展中具有抑制炎癥的作用。本研究應用褪黑素干預急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，觀察腎組織Ghrelin和NF-κB p65表達及腎組織中氧化應激相關指標的變化，探討褪黑素對腎損傷的作用機制。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：健康雄性SD大鼠72只，清潔級，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，體重180～250 g。按完全隨機法分為對照組、ANP組和褪黑素干預組，每組24只。采用腹腔注射6% L-Arg溶液(1.5 g/kg體重)3次、間隔1 h的方法制備ANP模型。褪黑素組于首次注射L-Arg前30 min腹腔內注射1%褪黑素50 μg/kg體重。對照組腹腔注射等容積生理鹽水。末次腹腔內注射后6、12、24 h分批處死大鼠。觀察大鼠腹腔內各臟器的變化，留取胰腺及腎組織，部分用10%甲醛固定，部分置-80℃保存，取血分離血清，-20℃保存。

2．胰腺和腎組織病理學檢查：由同一病理科醫師光鏡下觀察胰腺及腎組織病理變化，分別參考Kusske等[1]和雷文章等[2]標準評分。

3．腎組織Ghrelin、NF-κB p65 mRNA表達檢測：采用Trizol提取腎組織總RNA， RT-PCR檢測Ghrelin、NF-κB p65 mRNA表達。依據Gene Bank設計引物。NF-κB p65引物：5′-AGCTCAAGATCTGCCGAGTA-3′，5′-GATCTGCCCAGGTGGTAACAC-3′，擴增片段556 bp，擴增條件： 94℃ 5 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 45 s，共35個循環，72℃ 10 min；Ghrelin引物：5′-GTGTCTTCAGCGACTATCT-3′，5′-CCTGTCAGTGGTTACTTGTT-3′，擴增片段362 bp，擴增條件95℃ 5 min，94℃ 1 min、56℃ 40 s、72℃ 40 s，共35個循環， 72℃ 10 min；內參β-actin引物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′， 5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴增片段150 bp。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后使用凝膠成像系統分析。

4．血清淀粉酶活性及IL-6水平測定：由全自動生化檢測儀測定血清淀粉酶活性。應用ELISA試劑盒測定血清IL-6水平。

5．腎組織MDA、MPO、SOD含量測定：應用ELASA法測定丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)含量，按試劑盒說明書操作。

二、結果

1．胰腺及腎組織病理變化：對照組胰腺肉眼觀無變化，鏡下見胰腺腺泡結構完整。 ANP組胰腺外觀為灰白色、水腫明顯,部分有暗紅色出血樣改變；鏡下見胰腺腺泡水腫，炎性細胞浸潤, 腺小葉結構消失,灶性壞死、出血，病理變化隨時間延長而加重。褪黑素組胰腺外觀稍白，水腫，無出血樣改變；鏡下見腺泡輕度水腫，少量炎性細胞浸潤，部分腺泡細胞壞死、出血。胰腺病理評分見表1。

對照組腎臟大體未見明顯異常，鏡下腎皮質、髓質結構清晰。ANP組腎臟體積略大， 12 h后外觀呈暗紫色，24 h更明顯；鏡下見腎小球淤血，細胞腫脹，管腔擴大，部分小管上皮壞死，炎癥細胞浸潤，可見管型，病理變化隨時間延長而加重。褪黑素組腎臟大體改變與ANP無明顯差別；鏡下見腎小管細胞腫脹，偶見小管上皮壞死及炎癥細胞浸潤。腎臟病理評分見表1。

2．血清淀粉酶及IL-6水平變化：ANP組大鼠血清淀粉酶及IL-6水平均較對照組顯著升高(P值均<0.05)；褪黑素組較同時點ANP組明顯降低(P值均<0.05，表1)。

3．腎組織MDA、MPO、SOD含量變化：ANP組腎組織MDA、MPO含量較對照組顯著升高(P值均<0.05)，而SOD含量較對照組明顯降低(P值均<0.05)；褪黑素組腎組織MDA、MPO含量較同時間點ANP組明顯降低(P值均<0.05)，而SOD含量較ANP組明顯升高(P值均<0.05，表1)。

表1 各組大鼠胰腺和腎臟病理評分、血清淀粉酶和IL-6含量及腎臟MDA、MPO、SOD含量變化

注：與對照組比較,aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

4．腎臟Ghrelin、NF-κB p65 mRNA表達的變化： ANP組Ghrelin mRNA表達較對照組明顯減少(P<0.05)，且呈時間依賴性降低；褪黑素組Ghrelin mRNA表達較同時間點ANP組明顯增加。ANP組NF-κB p65 mRNA表達較對照組明顯增加，且呈時間依賴性；褪黑素組NF-κB p65 mRNA表達較同時間點ANP組明顯降低(P<0.05，圖1,表2)。

討論目前認為細胞因子和炎癥介質的持續過量釋放是導致ANP持續發展并造成急性腎功能衰竭的重要原因[3]。IL-6是炎性刺激下多種細胞釋放的介導急性時相反應的主要炎癥因子，是早期評價AP嚴重程度的最佳指標[4]。NF-κB是一類主要參與機體炎性分子表達調控的轉錄因子，參與多種原因引起的組織損傷[5]。ANP發生后，NF-κB活化，可增強TNF-α、IL-1β等細胞因子轉錄，使其產生和釋放增多，繼而再次激活NF-κB,又使IL-6和IL-8產生和釋放增多，放大最初炎癥信號，產生瀑布式級聯反應，造成腎臟結構及功能的損害。本實驗結果顯示，ANP大鼠血清IL-6大量產生，且腎臟NF-κB p65 mRNA表達也顯著增加，提示IL-6及NF-κB p65參與ANP時對腎臟損傷作用的機制。

C：對照組；A：ANP組；M：褪黑素組

組 別只數時間NF?κBp65mRNAGhrelinmRNA對照組86h0．39±0．060．68±0．08812h0．39±0．080．66±0．06824h0．31±0．040．69±0．07ANP組86h0．57±0．06a0．48±0．05a812h0．75±0．06a0．34±0．04a824h0．79±0．04a0．29±0．04a褪黑素組86h0．47±0．04ab0．56±0．04ab812h0．58±0．07ab0．57±0．07ab824h0．45±0．05ab0．59±0．07ab

注:與對照組比較,aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

MDA是脂質過氧化產物的降解產物，直接反映機體的脂質過氧化速率和強度；MPO是中性粒細胞的功能標志和激活標志，其表達水平代表著嗜中性多形核白細胞的功能和活性狀態[6]。而SOD是一種重要的氧自由基清除劑[7]。ANP發生時，腎組織微循環障礙、缺血缺氧，積存在腎小管內的大量脫落上皮細胞碎片及紅細胞碎片趨化大量的中性粒細胞浸潤，導致大量氧自由基產生，后者通過脂質過氧化和共價鍵結合等作用進一步損傷腎臟結構及功能[8]。本結果顯示，隨著ANP的進展，腎臟MDA、MPO含量逐漸升高，而SOD含量降低，考慮可能與ANP時腎組織大量中性粒細胞浸潤和脂質過氧化作用增強劑氧自由基增多大量消耗SOD有關。

Ghrelin是大鼠胃組織中發現的一種多肽[9]，分布在整個胃腸道、肝臟、胰島、腎臟中。目前不少研究證實，外源性Ghrelin在AP合并胰外器官損傷時能發揮抗炎抗氧化的保護作用[10]。本結果顯示，ANP組腎臟Ghrelin mRNA表達呈時間依賴性遞減，可能為ANP時大量炎癥介質產生的瀑布式級聯反應及脂質過氧化作用等導致了腎臟損傷，使腎臟ghrelin mRNA合成受阻。

褪黑素是松果體分泌的主要激素，能有效地清除多種氧自由基[11]，抑制各種炎癥介質和細胞因子的生成[12]。本結果顯示，外源性給予褪黑素后ANP大鼠的腎臟病理損傷減輕，腎臟NF-κB p65 mRNA表達減少，Ghrelin mRNA表達增加，MDA、MPO含量降低，SOD含量增加，提示外源性褪黑素可能通過抑制NF-κB p65的表達，減少炎癥介質和細胞因子的生成和釋放，并可能通過增加Ghrelin mRNA表達，清除多種氧自由基，發揮抗氧化作用，從而減輕腎損傷。

[1] Kusske AM, Rongione AJ, Ashley SW, et al. Interleukin-10 prevents death in lethal necrotizing pancreatitis in mice. Surgery, 1996,120: 284-288.

[2] 雷文章,韋靖江,沈文律,等.實驗性壞死性胰腺炎多器官損害與內毒素血癥的關系.中華實驗外科雜志,1995,12:131-132.

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[4] Triester SL，Kowdley KV．Prognostic factors in acute pancreatitis．J Clin Gastronterol,2002,34:167-176.

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[7] Kushleika J,Checkoway H,Woods JS,et al.Selegiline and lymphocyte superoxide dismutase activities in Parkinson′s disease.Ann Neurol,1996,39:378-381.

[8] Closa D,Rosello-Catafau J,Martrat A,et al.Changes of systemic in prostacyclin and thromboxane A2 in sodium taurocholate and cerulein-induced acute pancreatitis in rats.Dig Dis Sci,1993,38:33-38.

[9] Kojima M, Hosoda H, Date Y,et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature,1999,402:656-660.

[10] Deboer MD, Zhu X, Levasseur PR, et al. Ghrelin treatment of chronic kidney disease: improvements in lean body mass and cytokine profile. Endocrinology,2008,149:827-835.

[11] Poeggeler B, Saarela S, Reiter RJ,et al. Melatonina-highly potent endogenous radical scavenger and electron donor: new aspects of the oxidation chemistry of this indole accessed in vitro. Ann N Y Acad Sci, 1994,738: 419-420.

[12] Duelli D,Lazebnik Y.Cell fusion:a hidden enemy? Cancer Cell,2003,3:445-448.

2010-11-11)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.022

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唐國都，Email：tguodu02@yahoo.com.cn