胰島β細胞參與急性胰腺炎后胰腺再生過程的研究

胡國勇 趙嚴 沈杰 楊麗娟 熊杰 萬榮 郭傳勇 王興鵬

·論著·

胰島β細胞參與急性胰腺炎后胰腺再生過程的研究

胡國勇 趙嚴 沈杰 楊麗娟 熊杰 萬榮 郭傳勇 王興鵬

目的探討胰島β細胞在實驗性急性胰腺炎(AP)后胰腺再生過程中的作用。方法SD大鼠87只，按數字表法隨機分為對照組(15只)、糖尿病組(24只)、AP組(24只)和糖尿病+AP組(24只)。采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，60 mg/kg體重)或左旋精氨酸(L-Arg，2.5 g/kg體重，2次)方法分別建立糖尿病和AP模型。術后1、3、5、7 d分批處死大鼠。檢測血淀粉酶和血糖水平；計算胰腺濕重比；胰腺組織常規病理學檢查，計算胰腺壞死面積百分比和組織轉化區域百分比；免疫熒光檢測胰島β細胞的再生基因(Reg4)和胰島素的表達。結果注射STZ后，大鼠血糖明顯升高，注射L-Arg后大鼠胰腺組織水腫、壞死、炎細胞浸潤，血淀粉酶明顯升高，表明制模成功。制模后第3天糖尿病+AP組的胰腺壞死面積為(71.6±6.0)%，顯著大于AP組的(42.3±4.0)%；第7天的組織轉化面積為(45.6±5.4)%，顯著小于AP組的(78.5±6.4)%。糖尿病+AP組胰島β細胞的Reg4和胰島素表達均較AP組明顯減少。結論STZ破壞了胰島β細胞，加重精氨酸誘導的AP的損傷，并抑制胰腺的再生過程。

急性胰腺炎； 胰島β細胞； 胰腺再生； 再生基因4

腺泡細胞的死亡是急性胰腺炎的重要特征，在胰腺炎的發生、發展過程中起關鍵作用[1-2]。精氨酸誘導的急性胰腺炎(AP)腺泡細胞大量壞死，然而胰島和胰島周圍的腺泡細胞卻保留完整，提示胰島和(或)胰島周圍的腺泡細胞具有某種機制使其免于胰腺炎引起的損傷。此外，人類慢性胰腺炎時的胰腺腺泡細胞損傷較為嚴重，而胰島相對保留完整[3]。上述現象均提示胰島參與了胰腺炎后的抗損傷和修復過程。本研究旨在觀察胰島β細胞在急性胰腺炎后的抗損傷和修復過程中的作用。

材料與方法

一、實驗動物及分組

SD大鼠87只，SPF級，200～250 g, 8～9周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，適應性飼養1周。實驗前禁食16～18 h，自由飲水。按數字表法隨機分為對照組(15只)、糖尿病組(24只)、AP組(24只)和糖尿病+AP組(24只)。以左旋精氨酸(L-Arg，Sigma公司)2.5 g/kg體重腹腔注射兩次、間隔1 h的方法制備AP模型[4]。以鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)60 mg/kg體重腹腔注射一次方法建立糖尿病模型。根據文獻報道[5]，STZ注射3 d后，大鼠出現糖尿病，因此糖尿病+AP組大鼠在STZ注射3 d后再注射L-Arg，故糖尿病組和糖尿病+AP組以STZ注射后第3天為制模當天。分別于制模后第1、3、5、7天稱取大鼠體重，然后用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，心臟穿刺采血，離心分離血清；完整取出胰腺，去除血管、脂肪和腸系膜等結締組織后，稱取胰腺濕重，再置4%多聚甲醛中固定。

二、血清淀粉酶和血糖的檢測

血清淀粉酶檢測采用全自動生化儀(Roche公司)；應用快速血糖儀檢測即刻血糖水平。

三、胰腺組織濕重比

根據處死前大鼠體重和處死后的胰腺濕重，計算胰腺濕重百分比。

四、胰腺組織病理檢查

將固定的胰腺組織常規脫水、包埋、石蠟切片、HE染色，光鏡下檢查。參考文獻[6]計算胰腺壞死面積百分比，參考文獻[7]計算組織轉化區域百分比。

五、Reg4、胰島素蛋白檢測

采用免疫熒光方法檢測。兔抗胰島素單抗和羊抗Reg4多抗購自Santa Cruz公司，工作濃度分別為1∶200和1∶50。DyLight549-驢抗羊IgG和DyLight488-驢抗兔IgG購自Jackson Immuno Research公司，工作濃度1∶200。最后熒光顯微鏡觀察、攝片。

六、統計學分析

結 果

一、血糖的變化

對照組和AP組大鼠實驗制模當天的血糖水平分別為(8.1±1.7)、(8.3±1.2)mmol/L，兩組間差異無統計學意義。糖尿病組及糖尿病+AP組的血糖水平均較對照組和AP組顯著升高(P<0.01)，且始終維持在高水平，其中制模后第1天的血糖水平最高(表1)。

表1 各組大鼠制模后血糖的變化

注：與對照組或AP組比較，aP<0.01

二、血清淀粉酶的變化

制模后第1、3、5、7天對照組血淀粉酶水平分別為(2825±1030)、(2965±108)、(2605±91)、(2600±95)U/L；AP組為(8288±100)、(2751±114)、(2567±91)、(2523±102)U/L；糖尿病組為(2221±113)、(2370±95)、(2150±64)、(2305±107)U/L；糖尿病+AP組為(6777±65)、(1955±161)、(1817±90)、(2098±142)U/L。AP組于制模后第1天顯著高于對照組(P<0.01)，第3、5、7天與對照組無統計學差異；糖尿病組在每個時間點均顯著低于對照組(P值均<0.05)；糖尿病+AP組制模后第1天顯著高于對照組(P<0.01)，同時亦顯著低于AP組(P<0.05)，第3、5、7天顯著低于對照組(P值均<0.05)。

三、胰腺濕重比

制模后第1、3、5、7天對照組的胰腺濕重比分別為(0.498±0.052)%、(0.518±0.047)%、(0.538±0.052)%、(0.569±0.032)%；糖尿病組為(0.424±0.053)%、(0.431±0.045)%、(0.462±0.029)%、(0.456±0.036)%，均顯著低于對照組(P<0.05)；AP組為(0.785±0.092)%、(0.509±0.042)%、(0.524±0.062)%、(0.537±0.049)%，第1天時顯著高于對照組(P<0.01)，以后與對照組無顯著差異；糖尿病+AP組為(0.613±0.062)%、(0.389±0.037)%、(0.358±0.032)%、(0.392±0.040)%，第1天時顯著高于對照組(P<0.01)，第3、5、7天時顯著低于對照組(P值均<0.05)。

四、胰腺病理變化

對照組大鼠胰腺組織內可見多個胰島細胞團，胰島邊緣規整，細胞排列整齊，核呈圓形或橢圓形，染色質豐富均勻。糖尿病組和糖尿病+AP組依稀可見1～2 個胰島細胞團，胰島邊緣不規整，細胞排列紊亂，胞核固縮、碎裂，呈多邊形，染色質不均勻，有凋亡征象。AP組第1、3天時可見腺泡細胞壞死和炎性細胞浸潤，隨后出現導管復合體，第7天時導管復合體逐漸被腺泡細胞所取代；而糖尿病+AP組第1、3天時胰腺腺泡細胞壞死和炎性細胞浸潤較AP組明顯加重，第7天時纖維組織沉積，分割胰腺小葉，小葉內大量導管復合體持續存在(圖1)。對照組及糖尿病組胰腺壞死面積為3%～4%，無組織轉化。AP組1、3 d的的壞死面積為(54.3±4.6)%和(42.3±4.0)%；5、7 d的組織轉化面積為(38.5±4.3)%和(78.5±6.4)%。糖尿病+AP組1、3 d的壞死面積為(65.1±7.0)%和(71.6±6.0)%，顯著大于AP組(P值均<0.05)；5、7 d的組織轉化面積為(15.3±2.4)%和(45.6±5.4)%，顯著小于AP組(P值均<0.05)。

圖1 各組胰腺組織病理學改變(HE ×100)

五、胰島β細胞胰島素及Reg4表達的變化

糖尿病大鼠胰腺胰島細胞的胰島素表達明顯減少；AP組胰島細胞胰島素的表達無明顯改變，且同時表達Reg4和胰島素；糖尿病+AP組胰島細胞中Reg4和胰島素均明顯減少(圖2)。

圖2AP組和糖尿病+AP組大鼠的胰島Reg4和胰島素表達(免疫熒光 ×200)

討 論

許多研究表明，精氨酸能夠誘導胰腺腺泡細胞的壞死和炎性細胞浸潤，然而胰島和胰島周圍的腺泡細胞卻保留完整[6-8]。本研究也發現相似的現象，同時精氨酸誘導胰腺腺泡細胞損傷后，出現了一個胰腺自身修復和再生過程，即大量導管復合體的短暫形成，隨后導管復合體迅速消失，并被再生的腺泡細胞逐漸取代。Hegyi等[9]研究發現，CCK(cholecystokinin)類似物能夠促進胰腺的再生過程。Takacs等[10]研究也發現CCK-8能夠加速精氨酸誘導的胰腺炎后的再生過程，但不能促進糖尿病大鼠胰腺炎后胰腺的再生過程，提示CCK-8促進胰腺的再生需要胰島素來介導。以上結果提示，胰島細胞可能在精氨酸誘導的胰腺炎后的再生過程中起了重要的作用。

本實驗應用鏈脲佐菌素(STZ)選擇性破壞胰島的β細胞后，大鼠血糖明顯上升，血清淀粉酶低于正常對照組，而且胰腺重量明顯低于對照組，提示胰島細胞分泌的激素參與了胰腺腺泡細胞的生長以及胰酶的合成。盡管AP組大鼠在第1天時淀粉酶高于糖尿病+AP組，但病理損傷較該組有所減輕，可能由于胰島素表達降低而導致淀粉酶的合成減少。在正常胰腺組織中，Reg4僅表達于胰島細胞中，而在STZ誘導的糖尿病大鼠中，不僅胰島素在胰島中的表達明顯下降，而且Reg4在胰島中的表達也明顯減少，提示Reg4可能由胰腺的β細胞所產生。Reg1是最早發現的Reg家族成員，特異性表達于再生的胰島中[11]。隨后研究發現[12-13]，Reg1蛋白能夠促進β細胞的增殖從而降低90%胰腺切除和NOD糖尿病模型鼠的血糖水平。Reg4與Reg1為同一家族成員，是否有相似的作用有待于進一步的研究。

本研究還發現，STZ誘導的糖尿病大鼠加重了精氨酸誘導的胰腺損傷，同時也抑制了AP后胰腺自身的修復和再生過程。由于胰島素能夠促進腺泡細胞的生長和胰酶的合成[14]，因此其機制可能部分與胰島素的分泌減少有關。此外，除胰島素外，胰島β細胞還可能分泌其他的因子(如可能包含Reg4)，這些因子也可能參與了AP后胰腺的修復和再生過程。結合我們以前的研究結果[15]，重組Reg4蛋白能夠減輕精氨酸誘導的胰腺損傷，提示胰島β細胞通過分泌Reg4參與了胰腺炎后的抗損傷和修復過程。由于胰島細胞能夠分泌多種因子，因此胰島/Reg4軸在AP后胰腺再生過程中的作用有待進一步的研究。

[1] Gukovskaya AS, Pandol SJ. Cell death pathways in pancreatitis and pancreatic cancer. Pancreatology, 2004, 4: 567-586.

[2] Pandol SJ, Saluja AK, Imrie CW, et al. Acute pancreatitis: bench to the bedside. Gastroenterology, 2007, 132: 1127-1151.

[3] Bateman AC, Turner SM, Thomas KS, et al. Apoptosis and proliferation of acinar and islet cells in chronic pancreatitis: evidence for differential cell loss mediating preservation of islet function. Gut, 2002, 50: 542-548.

[4] Toma H, Winston J, Micci MA, et al. Nerve growth factor expression is up-regulated in the rat model of L-arginine-induced acute pancreatitis. Gastroenterology, 2000, 119: 1373-1381.

[5] Karunanayake EH, Hearse DJ, Mellows G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochem Soc Trans, 1975, 3: 410-414.

[6] Tani S, Itoh H, Okabayashi Y, et al. New model of acute necrotizing pancreatitis induced by excessive doses of arginine in rats. Dig Dis Sci, 1990, 35: 367-374.

[7] Mizunuma T, Kawamura S, Kishino Y. Effects of injecting excess arginine on rat pancreas. J Nutr, 1984, 114: 467-471.

[8] Dawra R,Sharif R,Phillips P,et al.Development of a new mouse model of acute pancreatitis induced by administration of L-arginine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,292:G1009-G1018.

[9] Hegyi P, Takacs T, Jarmay K, et al. Spontaneous and cholecystokinin-octapeptide-promoted regeneration of the pancreas following L-arginine-induced pancreatitis in rat. Int J Pancreatol, 1997, 22: 193-200.

[10] Takacs T, Hegyi P, Jarmay K, et al. Cholecystokinin fails to promote pancreatic regeneration in diabetic rats following the induction of experimental pancreatitis. Pharmacol Res, 2001, 44: 363-372.

[11] Terazono K, Yamamoto H, Takasawa S, et al. A novel gene activated in regenerating islets. J Biol Chem, 1988, 263: 2111-2114.

[12] Gross DJ, Weiss L, Reibstein I, et al. Amelioration of diabetes in nonobese diabetic mice with advanced disease by linomide-induced immunoregulation combined with Reg protein treatment. Endocrinology, 1998, 139: 2369-2374.

[13] Watanabe T, Yonemura Y, Yonekura H, et al. Pancreatic beta-cell replication and amelioration of surgical diabetes by Reg protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 3589-3592.

[14] Patel R, Singh J, Yago MD, et al. Effect of insulin on exocrine pancreatic secretion in healthy and diabetic anaesthetised rats. Mol Cell Biochem, 2004, 261: 105-110.

[15] Hu G, Shen J, Cheng L, et al. Reg4 protects against acinar cell necrosis in experimental pancreatitis. Gut, 2011, 60: 820-828.

2011-03-01)

(本文編輯：呂芳萍)

Involvementofpancreaticbetacellinpancreaticregenerationfollowingexperimentalacutepancreatitis

HUGuo-yong,ZHAOYan,SHENJie,YANGLi-juan,XIONGJie,WANRong,GUOChuan-yong,WANGXing-peng.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiTenthPeople′sHospital,SchoolofMedicine,TongjiUniversity,Shanghai200072,China

WANGXing-peng,Email:wangxp1965@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the role of pancreatic β cell on pancreatic regeneration following experimental acute pancreatitis.MethodsEighty-seven SD male rats were randomly divided into four groups: control group (n=15), STZ group (n=24), L-Arg group (n=24), STZ+Arg group (n=24). 60 mg/kg of STZ was administrated by intraperitoneal injection to induce the diabetes model. 2.5 g/kg body weight of L-Arg was administrated by intraperitoneal injection to induce the acute pancreatitis model. The rats were sacrificed 1, 3, 5, 7 d later and the serum levels of amylase and glucose were measured. Relative pancreatic weight (pancreatic weight/body weight) were measured. Pancreatic tissue underwent routine pathologic examination, and the percentage of area of necrosis and tissue transformation was calculated. The expression of Reg4 and insulin was performed by immunofluorescence.ResultsSerum level of glucose significantly increased after STZ injection. After L-Arg injection, serum level of amylase significantly increased, and there was pancreatic tissue edema, necrosis, infiltration of inflammatory cells, which suggested the successful model induction. The percentage of area of necrosis in STZ+L-Arg group was (71.6±6.0)% at the 3rd day, which were significantly higher than (42.3±4.0)% in L-Arg group; the percentage of area of transformation was (45.6±5.4)%, which were significantly lower than (78.5±6.4)% in L-Arg group. Expression of Reg4 in pancreatic islets of STZ+L-Arg group was significantly lower than those in L-Arg group.ConclusionsSTZ impairs pancreatic β cells, aggravates pancreatic damage following L-arginine induced pancreatitis and inhibits pancreatic regeneration.

Acute pancreatitis; Pancreatic beta Cells; Pancreatic regeneration; Reg4

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.018

教育部高等學校博士學科點專項科研基金(09DZ1906904)；上海市科技創新行動計劃重點項目(09JC412100)

200072 上海，同濟大學附屬第十人民醫院 上海市第十人民醫院消化內科(胡國勇、趙嚴、沈杰、楊麗娟、熊杰、萬榮、郭傳勇、王興鵬)

王興鵬，Email：wangxp1965@yahoo.com.cn