脂氧素A4對肝細胞生長因子誘導HepG2肝癌細胞血管生成相關細胞因子表達的影響

周曉燕， 王紅梅， 蔡震宇， 徐方云， 黃永紅， 朱 俊, 吳 萍， 葉篤筠

(1南昌大學醫學院病理生理系，江西 南昌 330006；2華中科技大學同濟醫學院病理生理系，湖北 武漢 430030 )

脂氧素A4對肝細胞生長因子誘導HepG2肝癌細胞血管生成相關細胞因子表達的影響

周曉燕1,2△， 王紅梅1， 蔡震宇1， 徐方云1， 黃永紅1， 朱 俊1, 吳 萍2， 葉篤筠2

(1南昌大學醫學院病理生理系，江西 南昌 330006；2華中科技大學同濟醫學院病理生理系，湖北 武漢 430030 )

目的探討脂氧素A4(LXA4)對肝細胞生長因子(HGF)誘導的HepG2肝癌細胞血管生成相關細胞因子表達的影響。方法體外培養HepG2肝癌細胞，實驗分為空白組、HGF處理組、HGF+LXA4處理組、HGF+脂氧素受體激動劑BML-111處理組。RT-PCR檢測脂氧素受體(ALX)表達情況，Western blotting檢測COX-2、MMP-2、MMP-9、IκBα和NF-κB p65的表達量，ELISA檢測TNF-α、IL-1β、VEGF和TGF-β分泌水平, 熒光素酶報告質粒檢測NF-κB轉錄活性。結果HepG2肝癌細胞表達ALX，LXA4和BML-111下調COX-2、 MMP-2和MMP-9，抑制TNF-α、IL-1β、VEGF和TGF-β分泌，并且干擾NF-κB轉位及其轉錄活性。結論脂氧素抑制HGF誘導HepG2肝癌細胞表達血管生成相關細胞因子，包括VEGF、COX-2、TNF-α、IL-1β、TGF-β、MMP-2及MMP-9，此效應可能通過干擾NF-κB活化實現。

脂氧素; 血管生成; 細胞因子類

新近報道，非甾體抗炎藥抑制肝癌細胞增殖、誘導凋亡并干擾其侵襲和轉移過程[1-3]。脂氧素(lipoxins, LXs) 已被證實是炎癥反應的重要“剎車信號” ，對多種炎癥細胞的功能和炎癥相關基因的表達具有廣泛調節作用[4]。更有趣的是：阿司匹林可以誘導LXs合成[5]；同時，肝臟內含有豐富的LXs前體[6]，并且肝臟損傷時可以檢測到大量LXs生成[7]。但是，迄今為止，LXs對肝癌有何影響無人報道。我們前期研究結果提示LXs抑制CoCl2誘導內皮細胞形成血管[8], 而血管形成是腫瘤生長和轉移的生物學基礎, 為此本文觀察了LXs及其受體激動劑5(S),6(R),7-三羥基庚酸甲酯[5(S), 6(R), 7-trihydroxyheptanoic acid methyl ester, BML-111]對肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)誘導的HepG2肝癌細胞血管生成相關細胞因子表達的影響。

材 料 和 方 法

1材料

RPMI-1640培養基為Gibco產品；胎牛血清購自浙江三利生物制品廠；LXA4和BML-111購自Cayman；重組HGF購自Sigma；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素1β (interleukin 1β, IL-1β)、 轉化生長因子 β (transforming growth factor β, TGF-β)和血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)檢測試劑盒均購自武漢博士德公司；脂氧素受體(lipoxin A4 receptor，ALX)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)和基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9)、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)、核因子-κB(nuclear factor-κ-gene binding, NF-κB) p65、IκBα(inhibitory protein of NF-κB)Ⅰ抗購自Santa Cruz；Trizol和Lipofectamine 2000購自Invitrogen; 逆轉錄試劑、熒光素酶檢測試劑盒和β-半乳糖苷酶檢測試劑盒購自Promega; NF-κB熒光素酶報告質粒為Clontech產品。

2材料

2.1細胞培養與分組 人肝癌細胞株HepG2(購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所)用RPMI-1640培養液培養在6孔培養板中，培養液中加入10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素，細胞培養在37 ℃﹑5% CO2培養箱中。按實驗設計將培養細胞分成3組：(1)空白對照組：用生理鹽水處理作為空白對照組;(2)HGF處理組：20 μg/L HGF處理細胞;(3) LXA4處理組：20 μg/L HGF與不同劑量LXA4或BML-111共同處理細胞。檢測HepG2肝癌細胞表面是否表達ALX時，HEK293細胞被用作陰性對照細胞。

2.2RT-PCR檢測脂氧素受體ALX表達 采用Trizol法提取各樣品總RNA，測定濃度定量后取4 μg進行逆轉錄。然后取1μL逆轉錄產物進行PCR反應。ALX上游引物為5’-CACCAGGTGCTGCTGGCAAG-3’，下游引物為5’-AATATCCCTGACCCCATCCTCA-3’。PCR反應條件為95 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 60 s，72 ℃ 1 min，循環30次，最后72 ℃ 10 min。產物于2%瓊脂糖凝膠電泳后照相并圖像分析。

2.3免疫印跡法檢測MMP-2、MMP-9、COX-2, IκBα和NF-κB p65表達水平 嚴格按照細胞裂解液說明書分別提取胞漿蛋白或核蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品(檢測MMP-2、MMP-9、COX-2和IκBα用胞漿蛋白，檢測NF-κB p65用核蛋白)煮沸變性后，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至硝酸纖維素膜上，置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。加入稀釋的MMP-2、MMP-9、COX-2、IκBα和NF-κB p65 Ⅰ抗4 ℃溫育過夜，TBST洗膜，置1∶8 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗中37 ℃溫育1 h，TBST洗膜。將膜與ECL反應5 min后，曝光于X光膠片上，顯影、定影，掃描后圖像分析。

2.4ELISA檢測TNF-α、IL-1β、TGF-β和VEGF分泌水平 各組細胞處理預設時間后收集培養上清，按照說明書依次加入樣品或標準品、生物素化抗體、酶結合物工作液、顯色液、顯色終止液，最后酶標儀450 nm測A450值。

2.5報告質粒熒光素酶檢測 24孔板細胞長至80%密度時，轉染NF-κB報告質粒或空載體，并同時轉染β-半乳糖苷酶報告質粒作為內參照， 6 h后更換培養液并加入刺激劑，溫育24 h。棄培養液，加入裂解液，將裂解產物轉入離心管渦旋振蕩15 s后4 ℃ 12 000×g離心2 min, 取上清液加入熒光素酶檢測試劑檢測熒光素酶活性，另取一部分上清液與β-半乳糖苷酶檢測試劑混勻，溫育 3 h后420 nm測β-半乳糖苷酶活性。

3統計學處理

結 果

1脂氧素受體ALX表達于HepG2肝癌細胞

如圖1顯示，陰性對照組未檢測到ALX表達；而空白對照組HepG2細胞可以檢測到ALX表達，并且HGF可以上調ALX。

Figure 1. The expression of lipoxin A4 receptor(ALX) in HepG2 cells. HEK293 cell line denoted the negative control. A:electrophoretogram of ALX mRNA; B:quantitative representation of the ratio of ALX to β-actin ±s.n=3.▲▲P<0.01 vs control group.

2脂氧素對HGF誘導HepG2細胞表達COX-2,MMP-2和MMP-9的影響

Western blotting 結果表明，HGF誘導COX-2、MMP-2和MMP-9的表達，而LXA4和BML-111明顯抑制此效應，見圖2。

Figure 2. Effects of LXA4 and BML-111 on HGF-induced COX-2, MMP-2 and MMP -9 expression in HepG2 cells.A:Western blotting analysis of COX-2,MMP-2 and MMP-9 protein expression;B:quantitative representation of the ratio of COX-2,MMP-2 and MMP-9 to β-actin. ±s.n=3.##P<0.01 vs control group; ▲▲P<0.01 vs HGF group.

3脂氧素對HGF誘導HepG2細胞分泌TNF-α、IL-1β、VEGF和TGF-β的影響

ELISA結果提示，LXA4和BML-111抑制HGF誘導HepG2肝癌細胞分泌TNF-α、IL-1β、VEGF和TGF-β，見圖3。

Figure 3. Effects of LXA4 and BML-111 on HGF-induced TNF-α, IL-1β(A), VEGF and TGF-β secretion(B) in HepG2 cells.s.n=5.##P<0.01 vs control group;▲P<0.05, ▲▲P<0.01 vs HGF group.

4脂氧素對HGF誘導HepG2細胞IκBα和NF-κBp65的影響

結果顯示，LXA4和BML-111抑制HGF誘導HepG2肝癌細胞IκBα降解、NF-κB轉位及其轉錄活性，見圖4。

Figure 4. Effects of LXA4 and BML-111 on HGF-induced IκBα degradation, NF-κB translocation(A) and NF-κB transcriptional activity(B) in HepG2 cells. ±s.n=3.## P<0.01 vs control group; ▲▲P<0.01 vs HGF group.

討 論

血管新生主要依賴于促血管生成因子的作用, 其中VEGF特異性最高、作用最強， 在刺激因素的作用下, 其表達增強并促進血管新生[9,10]。血管新生還需要MMP-2和MMP-9等降解血管基底膜和細胞外基質蛋白，它們的降解對血管生成所必須的內皮細胞遷移極為重要。為此, 本文觀察了LXA4和BML-111對HGF誘導HepG2細胞促進新生血管形成起重要作用的幾種細胞因子的影響,包括: VEGF、COX-2、TNF-α、IL-1β、TGF-β、MMP-2和MMP-9。

VEGF直接刺激血管內皮細胞分裂增殖, 最直接地參與促進血管生成。多種細胞因子誘導VEGF高表達，包括: TNF-α[11]、 IL-1β[12]、COX-2[13]、TGF-β[14]等，而且, 這些細胞因子自身也參與新生血管形成。本研究結果提示：(1)LXA4和BML-111抑制HGF誘導HepG2細胞表達VEGF(圖3), 即其可以干擾血管生成的直接誘導因素; (2) LXA4和BML-111下調HGF誘導MMP-2和MMP-9表達(圖2)，即干擾血管生成的間接誘導因素；(3) LXA4和BML-111減少HGF誘導HepG2細胞分泌TNF-α、IL-1β、COX-2和TGF-β(圖2、3)。

VEGF基因的啟動子區域存在NF-κB調節序列, 持續活化NF-κB可引起VEGF異常高表達。而且，其它血管生成相關細胞因子, 包括TNF-α、IL-1β、COX-2、TGF-β、MMP-2和MMP-9的表達均受到NF-κB的調控。靜息狀態時，NF-κB以無活性的形式與其抑制性蛋白IκBα結合存在于胞漿中; 在相應刺激的作用下，IκBα被磷酸化而降解，NF-κB才能由胞漿移位至胞核從而啟動相關基因的轉錄。即IκBα是NF-κB 的抑制性蛋白,其降解水平直接影響NF-κB的轉位水平和轉錄活性。為此, 本文觀察了脂氧素對HGF誘導HepG2細胞NF-κB轉位、轉錄活性及IκBα降解的影響。結果顯示：LXA4和BML-111抑制HGF誘導HepG2細胞IκBα降解、NF-κB轉位及其轉錄活性(圖4)。

綜上所述, LXA4和BML-111可以直接和間接地抑制肝癌血管新生, 此效應可能通過抑制NF-κB活化而實現。本研究提示脂氧素是干擾肝癌生長和轉移的潛在藥物。

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EffectsoflipoxinA4onhepatocytegrowthfactor-inducedangiogenesis-relatedcytokinesinHepG2cells

ZHOU Xiao-yan1, 2, WANG Hong-mei1, CAI Zhen-yu1, XU Fang-yun1, HUANG Yong-hong1, ZHU Jun1, WU Ping2, YE Du-yun2

(1DepartmentofPathophysiology,MedicalCollegeofNanchangUniversity,Nanchang330006,China;2DepartmentofPathophysiology,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScience&Technology,Wuhan430030,China.E-mail:xyn_zhou@yahoo.cn)

AIM: To explore the possibility that lipoxin A4(LXA4) regulates the expression of angiogenesis-related cytokines in HepG2 cells induced by hepatocyte growth factor(HGF).METHODSThe HepG2 cells were divided into control group, HGF treatment group, HGF+LXA4treatment group and HGF+BML-111(an agonist of lipoxin A4receptor) treatment group. The expression of lipoxin A4receptor in HepG2 cells was measured by RT-PCR. The protein levels of COX-2, MMP-2, MMP-9, IκBα and NF-κB p65 in the cells were determined by Western blotting. The release of TNF-α, IL-1β, VEGF and TGF-β in the supernatants of the cell culture was examined by ELISA. The activity of NF-κB transcription in HepG2 cells was tested by transfection and luciferase activity assay.RESULTSThe expression of lipoxin A4receptor was detected in HepG2 cells. LXA4and BML-111 were able to down-regulate HGF-induced production of COX-2, MMP-2 and MMP-9. The secretion of TNF-α, IL-1β, VEGF and TGF-β was also decreased. Furthermore, LXA4and BML-111 restrained HGF-induced IκBα degradation, NF-κB translocation, and the transcriptional activity of NF-κB in HepG2 cells.CONCLUSIONLXA4is able to inhibit HGF-induced angiogenesis-related cytokines, including VEGF, COX-2, TNF-α, IL-1β, TGF-β, MMP-2 and MMP-9, by inhibition of NF-κB activation.

Lipoxin; Angiogenesis; Cytokines

R364.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-017

1000-4718(2011)02-0300-04

2010-07-08

2010-11-30

△通訊作者 Tel：0791-6360562; E-mail: xyn_zhou@yahoo.cn