miR-26a mimics轉染人肝癌細胞株HepG2的表達蛋白質組分析*

劉友平， 李 娟， 代榮陽， 段春燕， 陳紹坤， 嚴冬梅， 陳川寧， 李 洪△

(瀘州醫學院 1 生物化學教研室,2人類疾病細胞信號與調控四川省高校重點實驗室，3 醫學生物學與遺傳學教研室, 四川 瀘州 646000)

·短篇論著·

miR-26a mimics轉染人肝癌細胞株HepG2的表達蛋白質組分析*

劉友平1， 李 娟2， 代榮陽1， 段春燕1， 陳紹坤3， 嚴冬梅1， 陳川寧1， 李 洪1△

(瀘州醫學院1生物化學教研室,2人類疾病細胞信號與調控四川省高校重點實驗室，3醫學生物學與遺傳學教研室, 四川 瀘州 646000)

目的通過分析microRNA-26a(miR-26a)mimics轉染對人肝癌細胞株HepG2 表達蛋白質組的影響，以確定miR-26a與肝癌發生發展的相關性。方法常規培養人肝癌細胞株HepG2，經miR-26a mimics轉染48 h后進行細胞周期分析，并裂解轉染72 h的HepG2細胞提取蛋白，雙向電泳分離，匹配對比各蛋白斑點的表達量，篩選主要差異表達蛋白進行質譜鑒定。結果HepG2細胞經miR-26a mimics轉染后細胞增殖受到抑制；其蛋白2-DE圖譜與對照組比較，差異表達超過2倍的蛋白斑點有11個。其中，有3個蛋白斑點為表達上調，有8個蛋白斑點為表達下調。質譜鑒定為：膜聯蛋白A1、過氧化物酶4、增殖細胞核抗原、載脂蛋白A1、細胞色素C 氧化酶5a、細胞周期蛋白E2、磷酸核糖焦磷酸激酶3、周期素依賴性蛋白激酶1和磷脂酰乙醇胺結合蛋白。結論miR-26a可能通過影響上述蛋白分子的表達，直接或間接地調控HepG2肝癌細胞的增殖、分化和死亡，以發揮其抗癌作用。

miR-26a mimics； 微小RNA； HepG2細胞； 蛋白質組

微小RNA(mircoRNAs，miRNAs)是一類長度為21-23 核苷酸，進化上比較保守的非編碼單鏈小RNA 分子，可識別特異的mRNA，影響靶mRNA 的穩定性或抑制其翻譯，進而調節靶基因的表達，參與調控細胞的增殖、分化、發育、死亡和代謝等生理過程[1，2]。目前預測人類基因組中約有1 000個miRNA，它們可能對約30%的人類基因轉錄本起調控作用。超過50%的miRNAs基因位于癌癥相關基因組區域或脆性位點上[3]。新近研究表明miRNAs異常表達與腫瘤的發生、發展密切相關，不同類型的腫瘤具有特異的miRNAs異常表達譜[4,5]，它們與腫瘤的發生、病理分級、臨床分期、耐藥性及預后等密切相關。

miR-26a在多種組織中廣泛表達，但對于其生物學功能還知之甚少[6]。目前多項研究證實，miR-26a在多種惡性腫瘤中表達失調[7，8]，并可能參與了腫瘤的發生和發展過程。已有研究指出，miR-26a在正常肝臟中呈高豐度表達，但在肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中表達卻顯著下調[9]，其分子機制不詳。本實驗以人肝癌細胞株HepG2為研究對象，采用比較蛋白組學的研究技術并結合質譜(MS)鑒定技術，篩選和鑒定經miR-26a mimics轉染后肝癌細胞株HepG2的差異表達蛋白質，以便為進一步研究miR-26a參與肝癌發生發展的分子機制提供線索。

材 料 和 方 法

1材料

1.1實驗對象 人肝癌細胞株HepG2，購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2主要試劑和儀器 miR-26a mimics及對照的mimic購自上海吉瑪制藥技術有限公司，miR-26a mimics序列為 5’-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3’，陰性對照的mimic序列為 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；DMEM培養基購自Sigma;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、超純尿素、二硫蘇糖醇、CHAPS、甘氨酸、TEMED、TBP、過硫酸銨、十二烷基磺酸鈉、固相pH梯度干膠條(pH 3-10，17cm)和礦物油購自Bio-Rad；蛋白分子量marker和苯甲基磺酰氟(PMSF)購自碧云天生物技術研究所；其它常規試劑均購自GE Healthcare。低溫臺式離心機(TDZ4-WS)購自長沙湘儀離心機儀器有限公司；雙向電泳系統、ChemiDoc XRS蛋白凝膠成像系統購自Bio-Rad；EPICS流式細胞儀。

2方法

2.1細胞培養及細胞周期分析 HepG2肝癌細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃、5% CO2條件下培養。傳代培養至細胞對數生長期，隨機將細胞分為對照組和實驗組2組。采用脂質體轉染法將miR-26a mimics和對照mimics分別轉染實驗組和對照組HepG2細胞24 h后，細胞置于無血清DMEM培養基中饑餓12 h，饑餓后換用DMEM完全培養基繼續培養。12 h后離心收集細胞，棄上清，用預冷PBS洗細胞2次，加入預冷70%乙醇，于4 ℃固定過夜。離心收集細胞，PBS洗細胞1次，加入PBS溴化乙啶染色液(含50 mg/L PI, 100 mg/L RNase A, 0.2% Triton X-100)37 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測。

2.2細胞轉染及細胞蛋白提取與定量 HepG2肝癌細胞培養條件同上，至細胞對數生長期，隨機將細胞分為對照組和實驗組2組。轉染試劑為Lipofectamine 2000，具體方法如下：以合適的密度將HepG2接種到6孔培養板上，12 h后細胞達到80%-90%的融合后進行轉染。用無血清培養基245 μL分別稀釋Lipofectamine 2000(5 μL)和miR-26a mimics(5 μL)或對照mimics(5 μL)。溫育5 min后，混合稀釋好的Lipofectamine 2000和mimics，指彈法混勻，溫育25 min后分別加入細胞培養液。細胞在37 ℃、5%CO2中孵育6 h后更換正常培養基，HepG2細胞繼續培養66 h。對照組和實驗組HepG2細胞用0.25%的胰酶消化并離心。PBS液重懸細胞并轉移至EP管內(每組各收集1管)，10 000 ×g離心5 min。各EP管加細胞裂解液(8 mol/L 尿素，4% CHAPS，5 mL/L Bio-lyte 3/10，1‰TBP)300 μL，冰浴30 min(其間間斷振蕩2-3次)后13 000 ×g離心30 min。上清液采用Brandford法測定蛋白濃度。重復細胞轉染過程并分批收集細胞3批。

2.3蛋白質組雙向電泳分離 各組蛋白樣品150 mg，加水化液(8 mol/L 尿素，4% CHAPS，DTT 10 g/L，Bio-lyte 3/10 5 mL/L，0.1%溴酚藍 痕量)至總量350 μL/膠條，混勻后加入水化槽，放上pH 3/10的IPG膠條，1 h后加入礦物油覆蓋膠條過夜。將水化后的膠條轉移至等電聚焦(IEF)電泳系統(Bio-Rad)，于17 ℃進行聚焦，程序設置為250V，2 h → 500 V，1 h → 1 000 V，1 h → 5 000 V，2 h →10 000 V，總伏時數6萬伏時結束IEF電泳。平衡2次后用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠按照Bio-Rad公司說明書進行第二向電泳分離。最后采用銀染法進行染色獲得2-DE圖譜。每批細胞蛋白重復雙向電泳3次。

2.4凝膠成像及雙向電泳圖譜分析 將染色后的凝膠置ChemiDoc XRS凝膠成像系統中照相成像。采用ImageMaster 2D Platinum 5.0(Amersham) 雙向電泳圖譜分析軟件進行斑點自動識別、半定量檢測及配對分析。獲得各蛋白斑點的實驗等電點(isoelectric point,pI)和分子量(molecular weight,MW)，篩選每批比較標準化總灰度值(%Vol)均相差2倍及以上的蛋白斑點，采用基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)進行質譜檢測。質譜檢測和蛋白斑點的匹配鑒定由北京華大中生科技發展有限公司完成。

3統計學處理

數據的統計分析在Excel及SPSS 11.0軟件上進行。

結 果

1miR-26amimics轉染后細胞的生長狀態

實驗組和對照組HepG2肝癌細胞在未處理之前生長狀態相當，且均處于對數生長期。細胞分別經miR-26a mimics和對照mimics處理48 h后，用流式細胞儀檢測各組細胞周期情況，可見HepG2經miR-26a mimics處理后細胞增殖明顯受到抑制(P<0.05,n=5),見圖1。

Figure 1. Phases of the cell cycle of HepG2 cells treated with or without miR-26a mimics for 48 h. Cell population of each phase was measured using flow cytometry.±s.n=3.*P<0.05 vs control value.

2雙向電泳及蛋白斑點匹配分析

HepG2肝癌細胞表達蛋白質組經雙向電泳分離和銀染后獲得的2-DE圖譜見圖2。各蛋白斑點分離較好，大多數分布在pI 4-8，分子量20-85 kD的范圍內。經ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件分析，對照組共有可穩定重復的蛋白斑點(1 345±65)個，實驗組共有可穩定重復的蛋白斑點(1 220±48)個，對照組與實驗組自動匹配配對(883±31)對，匹配率約72%。

圖2和圖3中箭頭所示為每批3次雙向電泳結果均出現標準化總灰度值(%Vol)相差達2倍以上的蛋白斑點。圖3A、C、D為對照mimics轉染HepG2 72 h后的雙向電泳結果，圖3 B、D、F為miR-26a mimics 轉染HepG2 72 h后的雙向電泳結果。從圖3和表1可見：蛋白點1、2和4的表達明顯上調，而蛋白點3、5、6、7、8、9、10和11的表達則明顯下調。

Figure 2. The two-dimensional electrophoresis patterns of HepG2 cells with control mimics treatment(A) and HepG2 cells with miR-26a mimics treatment(B). The proteins over/under-expressed by more than 2 folds between the two groups were shown by the arrows.

Figure 3. The enlarged images of the 11 identified protein spots with differential expression levels between control group and miR-26a mimics treatment group(A，C and E were control group; B，D and F were miR-26a mimics treatment group; arrows showing the corresponding spots or location ).Spot 1,2 and 4 were obviously over-expressed while spot 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 and 11 were under-expressed in miR-26a mimics treatment group compared with control group.

3蛋白斑點的質譜鑒定

采用MALDI-TOF-MS分別對圖3中11個差異表達的蛋白斑點進行肽指紋圖譜分析。使用NCBInr蛋白質數據庫在Mascot搜索引擎(http:∥www. matrixscience.com)上進行數據解析，搜索物種(species search)為人，將所搜索到的結果， 結合雙向凝膠電泳相應點的表現：等電點、分子量及質譜匹配肽段的多少( 3個片段以上)和覆蓋率(>13%) 以及蛋白檢索得分進行綜合分析，共鑒定出9種蛋白。其中，斑點9和10為同一種蛋白，斑點6未獲鑒定結果，具體相關信息見表1。

討 論

國內外研究發現，肝癌中存在miRNAs的異常表達，因而推測miRNAs參與了肝細胞癌變的病理過程[4]。根據差異表達的miRNAs來區分肝癌組織與正常組織的精確度遠遠高于差異表達的編碼基因。由此可見，把關鍵miRNA作為肝癌生物診治的靶分子可能會比把編碼基因作為靶分子更加有效[10,11]。

表1 差異表達蛋白斑點的質譜鑒定結果

本實驗通過雙向電泳和質譜技術對HepG2肝癌細胞中miR-26a mimics轉染后表達蛋白組的變化進行了分析，對標準化總灰度值相差達2倍以上的差異表達蛋白斑點進行質譜鑒定，發現這些蛋白質為：膜聯蛋白A1、過氧化物酶4、增殖細胞核抗原、載脂蛋白A1、細胞色素C氧化酶5a、磷酸核糖焦磷酸激酶3、周期素依賴蛋白激酶1、磷脂酰乙醇胺結合蛋白和周期素E2。其中，膜聯蛋白A1、過氧化物酶4和載脂蛋白A1(蛋白斑點1、2、4)的表達明顯上調，而增殖細胞核抗原、細胞色素C氧化酶5a、磷酸核糖焦磷酸激酶3、周期素依賴蛋白激酶1、磷脂酰乙醇胺結合蛋白和周期素E2(蛋白斑點3、5、7、8、9、10、11)的表達則明顯下調,見圖3。

膜聯蛋白A1是鈣和磷脂結合蛋白，在很多方面發揮重要生物學功能，參與細胞增殖和死亡信號的調節、凋亡細胞的吞噬以及腫瘤的發生與發展，具有抗細胞增殖和誘導凋亡的作用。已有研究表明，膜聯蛋白A1的抗增殖作用是通過激活MAPK/ERK信號途徑實現的。若通過基因轉染，使膜聯蛋白A1過度表達，可以減弱細胞的生長和克隆形成能力，并且增加細胞凋亡[12]。本實驗發現肝癌細胞HepG2經miR-26a mimics轉染后表達量出現明顯上調，見圖3 C、D。可見，膜聯蛋白A1可能參與了miR-26a抵抗肝癌細胞HepG2的增殖和誘導HepG2發生凋亡的作用。

周期素是調控細胞周期和變構激活周期素依賴性蛋白激酶(CDKs)所必需的調節亞基[13]。以周期素為核心的G1/S期細胞周期網絡的調控系統，是腫瘤發生和發展中最常改變的共同通路。目前已發現在哺乳動物細胞中有大約20種周期素和10種CDKs。其中周期素E2的表達水平在非轉化的細胞中幾乎難以檢測到，而在腫瘤源性細胞中周期素 E2 mRNA的表達則明顯高于正常對照[14]。本實驗中，肝癌細胞HepG2經miR-26a mimics轉染后周期素 E2的表達出現明顯下調，見圖3 E、F，此結果不僅與相關的文獻報道相符，而且進一步證實了miR-26a的高表達可能通過下調周期素D2 和周期素E2的水平來抑制肝癌細胞的細胞周期，從而發揮其抑癌作用[9]。

增殖細胞核抗原(PCNA)是DNA復制所必需的一種聚合酶的附屬蛋白，對細胞由G1期向S期過渡起調節作用，其含量的變化與細胞增殖的進程同步，可作為衡量細胞增殖狀態的客觀指標之一[15]。一般認為，腫瘤分化程度越低，其增殖能力越強，PCNA表達也越高。本實驗發現，肝癌細胞HepG2經miR-26a mimics轉染后PCNA的表達量出現明顯下調，見圖3 A、B，說明miR-26a可通過調控PCNA的表達而參與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡和周期調控。除此之外，經miR-26a mimics轉染后CDK1和磷脂酰乙醇胺結合蛋白的表達量也出現明顯下調，見圖3 C、D，相關報道證實它們也與細胞周期調控相關[16，17]。

腫瘤的發生發展與細胞增殖和凋亡的失調密切相關。本實驗通過表達蛋白質組學技術發現肝癌細胞HepG2經miR-26a mimics轉染后出現顯著差異表達的蛋白質參與了細胞的增殖、分化、凋亡調節及細胞代謝等生理活動，見表1。表達上調的蛋白，如膜聯蛋白A1主要起促進細胞凋亡的作用。而表達下調的蛋白，如PCNA、cyclin E2、CDK1和PEBP1主要參與細胞周期的調控。因此，miR-26a可能通過調控這些蛋白的表達，參與肝癌細胞周期的調控以抑制肝癌細胞的增殖，從而達到抑制肝癌的發生發展，這與結果圖-1較吻合。通過對這些差異表達蛋白質分子機制的深入研究，將為闡明miR-26a的抗癌作用提供進一步的線索和依據。

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AnalysisofexpressiveproteomeinhumanhepatocarcinomacellHepG2transfectedwithmiR-26amimics

LIU You-ping1, LI Juan2, DAI Rong-yang1, DUAN Chun-yan1, CHEN Shao-kun3, YAN Dong-mei1, CHEN Chuan-ning1, LI Hong1

(1DepartmentofBiochemistry,2KeyLaboratoryofSichuanCollegesandUniversitiesforCellSignalandRegulationinHumanDiseases,3DepartmentofMedicalBiologyandGenetics,LuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China.E-mail:lihong7188@163.com)

AIM: To determine whether microRNA-26a(miR-26a) is involved in development of liver cancer by analysis of proteomic expression profile of human hepatocarcinoma cell HepG2 transfected with miR-26a mimics.METHODSHepG2 cells were cultured by a routine method and transfected with miR-26a mimics for 48 h for cell cycle analysis. The expressive proteome profiles of HepG2 cells with or without miR-26a mimics treatment were established by the methods of two-dimensional electrophoresis separation following lysis of the cells and extraction of the proteins. The proteomic expression profiles were analyzed by comparative proteomics technique to discover the important protein spots with differential expression. The identification of the proteins was conducted by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS).RESULTSmiR-26a brought down the proliferation of HepG2 cells. Total 11 protein spots with alteration of expressive amounts more than 2 times were successfully identified in the proteomic expression profile of HepG2 cells treated with miR-26a mimics, including annexin A1, peroxiredoxin 4, proliferating cell nuclear antigen, apolipoprotein A1, cytochrome C oxidase subunit 5A, cyclin E2, ribose-phosphate pyrophosphokinase 3, cyclin-dependent kinase 1 and phosphatidylethanolamine-binding protein 1. Among these, the expression of 3 protein spots was up-regulated and 8 of them was down-regulated.CONCLUSIONmiR-26a contributes to the anti-cancer effect by expressive regulation of the proteins mentioned above, or directly or indirectly controls the proliferation, differentiation and death of hepatocarcinoma cells.

miR-26a mimics; microRNA; HepG2 cells; Proteome

Q291

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-029

1000-4718(2011)02-0367-05

2010-08-02

2010-10-23

國家自然科學基金資助項目(No.81000886)；四川省教育廳科技基金資助項目(No.09ZA050)；四川省衛生廳科技基金資助項目(No.2007-431)

△通訊作者 Tel:0830-3160283； E-mail: lihong7188@163.com