大鼠活體心肌缺血再灌注損傷模型的建立與綜合評估*

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(廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院1急危重癥醫學部，2廣東省心血管病研究所心內科, 3醫學研究中心，4圖書館， 廣東 廣州 510080)

·實驗技術·

大鼠活體心肌缺血再灌注損傷模型的建立與綜合評估*

鄧宇珺1，符永恒3，譚寧2△，曾紅科1，單志新3，林秋雄3，李曉紅3，董小莉2，余細勇3，楊敏3，譚衛萍4，蘇健3

(廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院1急危重癥醫學部，2廣東省心血管病研究所心內科,3醫學研究中心，4圖書館，廣東廣州510080)

目的構建并評估大鼠活體心肌缺血再灌注損傷(I/R)的實驗動物模型。方法將清潔級成年SD雄性大鼠72只，隨機分為正常組、假結扎組和I/R模型組, 手術的兩組全麻下開胸暴露心臟，假結扎組只過線不結扎，模型組使用“U形金屬管”進行冠狀動脈左前降支結扎，持續心電圖監測，并于再灌注2 h與4 h后進行血漿生化﹑心肌組織學的檢測。結果與正常組和假結扎組比較，I/R模型組心電圖有明顯ST-T改變和再灌注后病理性Q波，再灌注2 h和4 h時存在比較明顯的ST-T改變；血標本檢測示心肌型肌酸激酶同功酶(CK-MB)、心肌鈣蛋白I(cTnI)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，T-SOD水平在2 h和4 h也應激性升高(P<0.05)；心肌組織病理學檢測顯示模型組左心室心肌損傷疤痕明顯，且2 h模型組左室心肌存在間隔性梗死區域，4 h模型組心肌組織區域性梗死和梗死面積明顯增加；TUNEL法與Bcl-2﹑Bax蛋白實驗顯示2 h和4 h心肌細胞凋亡數量明顯增加；Bcl-2/Bax蛋白表達陽性細胞比值下降顯著(P<0.01)。結論成功建立大鼠活體心肌I/R模型，模型大鼠的心電圖、血清學、心梗面積﹑心肌細胞凋亡和心肌組織病理學等發生顯著改變。

大鼠； 再灌注損傷； 細胞凋亡

隨著老齡化人口的增多，臨床上由于心肌缺血引起的一系列心血管病越來越常見，且治療效果欠佳。心肌缺血及藥物治療后引起再灌注細胞損傷、細胞結構改變和受破壞的機制如何，尚需進一步研究。目前對心肌缺血的研究不斷深入，基礎研究包括細胞水平研究和動物實驗研究。所以成功建立可靠的活體心肌缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion,I/R)的實驗動物模型至關重要。本實驗利用現有較為先進的儀器設備條件和改良方法建立活體I/R模型，并進行多指標檢測與評估分析。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物與分組 清潔級成年健康的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只，體重250-300 g，購于中山大學實驗動物中心，許可證號為SCXK(粵)2008-0020。隨機將大鼠分為正常組(N,n=12)、假結扎組(sham,n=12)和心肌缺血再灌注模型組(I/R組)，后者又分為：(1)心肌缺血35 min，再灌注2 h組(I/R 2 h,n=24)；(2)心肌缺血35 min，再灌注4 h組(I/R 4 h,n=24)。

1.2儀器與試劑 TKR-200C小動物呼吸機(江蘇省特力麻醉呼吸設備公司)；Pclab-3084科研型生物醫學信號采集處理系統(北京微信斯達科技發展有限責任公司)，測心電圖；MiVnt圖像分析軟件系統(上海光學儀器廠)。(1)2%伊文氏藍(Evans blue)； (2)1%氧化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)。

1.3活體I/R模型的建立方法 參考文獻[1，2]的方法進行改良，用自制“U型合金管”壓管法：SD大鼠術前12 h禁食，可飲水；以鹽酸氯胺酮(規格：100 mg/2 mL)4.5-7.5 mg/kg和地西泮(規格：10 mg/2 mL)3-4.5 mg/kg進行肌肉注射麻醉后，仰臥固定四肢與頭部。記錄Ⅱ導聯心電圖，頸部和胸部脫毛，消毒，剪皮，鈍性分離并暴露氣管，切開立即用24 G×0.75、0.7 mm×1.9 mm規格的靜脈留置針前軟管(1.5 mm×2.0 mm)行氣管插管，連接小動物呼吸機(通氣：95%O2和5%CO2混和氣體，濕度中度，呼吸頻率80次/min，呼吸比為1∶2.5,工作壓力0.01 MPa)；然后，于3-4肋間切皮鈍性分離開胸。拉鉤拉開，破心包膜暴露心臟，在肺動脈圓錐左側與左心耳交界下緣2-3 mm處，以6/0無創縫合針絲線，進針深度1.5-2 mm,寬2-3 mm,置“U形金屬管”以壓管法活結結扎左冠脈前降支(left anterior descending,LAD)，肉眼觀心臟左室壁出現變暗變紫，且心電圖呈示ST段明顯抬高(>0.25 mV)為結扎成功。35 min后，松開活結復灌，可觀察到缺血區心肌慢慢變紅色，紫紺區變小；再灌注2 h與4 h，心電圖ST段逐漸下降近一半(0.15 mV)左右。

1.4左心室心肌損傷區及梗死區面積的檢測 缺血再灌注結束后，再結扎阻斷LAD,先行腹腔靜脈采血4 mL后，經靜脈注射2% Evans blue 1.5 mL，待2-3 min大鼠嘴舌均呈藍色后，取心臟，除去右心房右心室，留左心室即置于-20 ℃冰凍25 min；用刀片將左心室按2.0-2.5 mm厚度切成5片；立即轉到預溫37 ℃的1%TTC磷酸鹽緩沖液中染色10-15 min。肉眼可觀察到：梗死區心肌為白色，非缺血區為紅色，而缺血損傷的心肌呈淡藍色。然后，將切片置于10%中性甲醛液中固定24 h，用800萬像素數碼相機拍照。圖片采用MiVnt圖像分析軟件系統進行分析，計算出每只實驗大鼠的左心室總橫截面面積，缺血危險面積和梗死區面積，求出缺血危險區面積/左心室總截面面積﹑梗死區面積/缺血危險區面積的百分比為心肌梗死區面積。

1.5心肌損傷標志物和氧化應激相關指標的檢測 用分離的血漿進行心肌型肌酸激酶同功酶(MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB)和心肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)免疫發光法檢測(貝克曼全自動儀)；而且用化學法測試氧化應激相關的一氧化氮(nitric oxide, NO)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，以及總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性(購于南京建成生工所)。

1.6心肌細胞凋亡指數與Bcl-2﹑Bax蛋白的檢測 先行心肌石蠟切片,心肌組織于4%甲醛(pH7.4)固定48 h(4 ℃)，然后置于75%乙醇中，再做常規石蠟包埋后，進行心肌橫向切片(厚度3-4 μm)，烤干后置室溫備用。(1)TUNEL法檢測心肌細胞凋亡率：應用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶介導dUTP缺口末端標記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)標記心肌細胞凋亡細胞核。在酶的介導之下，使熒光素化的dUTP 標記于DNA斷裂后的3'-OH末端，使過氧化物酶連接到DNA的斷點，加入熒光顯色劑和DAPI顯色，在波長465-495nm時熒光顯微鏡下觀測到心肌凋亡細胞的細胞核呈綠色；而同樣背景在激發光波長為330-380nm下，所有心肌細胞核呈藍色。各拍攝6個400倍放大視野，分別計算藍色心肌細胞總數和綠色凋亡細胞總數，然后，計算出心肌細胞平均凋亡指數(apoptotic index, AI=凋亡細胞總數/心肌細胞總數×100)來表示缺血再灌注損傷細胞凋亡情況。(2) 免疫組化法檢測心肌組織Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)﹑Bax(Bcl associate X protein)蛋白：用鏈霉素蛋白-過氧化物酶(streptavidin peroxidase, SP)免疫組化法，以Bcl-2與Bax單抗進行免疫組化染色，加DAB酶底物顯色呈棕色為陽性反應；同時，用惡性淋巴瘤組織切片做SP免疫組化染色陽性對照，而以非免疫血清代替Bcl-2和Bax單抗做陰性對照。在光學顯微鏡下計算6個高倍視野(×400)中的Bcl-2與Bax陽性細胞數和所占總細胞數比例的均值，再求Bcl-2/Bax蛋白表達陽性細胞比值。

2統計學處理

結 果

1使用“U形金屬管”成功建立了活體大鼠心肌缺血再灌注模型

“U形金屬管”是利用錫鋁合金剪切、卷曲制成，其“U”形利于結扎時活結的固定,見圖1。

2心電圖

同N組和sham組比較，I/R組心電圖有明顯的ST段改變，且復灌后2 h和4 h還存在比較明顯的ST-T改變及抬高的較寬的病理性Q波，這是建立模型成功的標志，見圖2。缺血35 min時心率增快，復灌后有心率失常且以短期性室性心動過速和室性早搏為主。

Figure 2. Comparison of electrocadiogram(ECG) in different groups. A：normal rat ECG before coronary artery ligation;B: ECG of sham group at 2 h; C: ECG of sham group at 4 h; D: ECG after ligation; E: ECG of I/R group 2 h after reperfusion; F：ECG of I/R group 4 h after reperfusion.

3左室心肌缺血區及梗死區面積結果

(1)HE染色顯示：心肌組織損傷區有明顯的炎癥細胞浸潤；心肌細胞變形，胞核體積變大。(2)TTC染色示：缺血復灌2 h時左室心肌組織出現了心肌梗死區和部分損傷區，4 h時梗死區因細胞線粒體內缺乏琥珀酸脫氫酶呈灰白色；sham組心肌組織沒有缺血梗死而呈紅色,見圖3。2 h和4 h模型組同sham組比較，心肌梗死面積明顯增加(P<0.01)，見表1。

Figure 3. Comparison of myocardial infarct size in sham, I/R 2 h and I/R 4 h groups. A: sham group:B: I/R 2 h group; C: I/R 4 h group.

表1 心肌梗死面積和細胞凋亡指標結果

4細胞凋亡率與Bcl-2﹑Bax蛋白的檢測結果

(1)心肌切片TUNEL法細胞核熒光染色查示：心肌缺血再灌注后2 h、4 h心肌細胞凋亡數量增加明顯，而假結扎組心肌細胞凋亡極少。(2)心肌組織免疫組化法檢測胞漿Bcl-2和Bax蛋白染色提示：假手術組僅有極少數散狀的Bcl-2與Bax蛋白陽性細胞，而缺血再灌注(2 h、4 h)組Bax蛋白明顯增加，Bcl-2蛋白也略有增加。但同假手術組比較模型組Bcl-2/Bax比值下降顯著(P<0.01)，見表 1。這進一步說明缺血再灌注損傷促進了心肌細胞凋亡。

5血漿CK-MB﹑cTnI和NO﹑MDA﹑T-SOD與GSH-Px檢測結果

(1)心肌梗死標志物CK-MB﹑cTnI在2 h和4 h模型組中較sham組明顯增加(P<0.01)。(2)血中氧化應激指標MDA和NO含量升高明顯(P<0.01)，而T- SOD和GSH-Px的活性升高也明顯(P<0.05),見表2。這些結果證明心肌損傷和梗死同時存在，自由基損傷作用與抗氧化機制已啟動。

表2 血漿指標檢測結果

討 論

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia and reperfusion injure，MI/R) 是臨床心絞痛、AMI早期再灌注、經皮穿刺冠狀動脈腔內成形術及心臟移植術后等心功能不全和心律失常的主要病理基礎[3]；也是近年來臨床心血管病治療中備受關注且較突出的問題[4]。心肌缺血再灌注損傷的臨床表現是心肌收縮功能下降﹑冠脈功能障礙﹑微小血管受損，并發生心肌組織水腫﹑黏附因子增加和白細胞浸潤，從而引起細胞凋亡與心肌梗死，最終導致心臟功能減弱。有研究報道，同MI/R相關的因素有自由基損傷作用﹑微血管損傷﹑鈣超載﹑補體激活﹑中性粒細胞﹑內皮細胞功能失調﹑血小板﹑凋亡和心肌能量代謝障礙等[5，6]。

而建立I/R模型是進行缺血再灌注損傷及其心肌保護機制研究的重要手段。大鼠MI/R造模常用方法為推管法和結扎法，這2種方法存在操作困難和嚴重磨損心肌﹑造成過多出血等問題。我們在近十年成功結扎LAD構建動物急性心肌梗死模型操作技術的基礎上[7]，利用自制的“U形金屬管”(錫鋁合金)進行壓管法活結結扎LAD，成功制備活體MI/R實驗模型。“U形金屬管”的“U”形利于結扎時的活結固定。以前常用墊片行缺血再灌注實驗時，因墊片軟，細細的結扎線可能會劃破墊片表面、陷入墊片，加上實驗中動物血液沾染等問題，在松解活結時，可能出現松解障礙，影響再灌注的順利開始；而“U形金屬管”是金屬制作，活結結扎在其表面，不會出現上述問題，松解活結時無障礙，保障再灌注的順利開始；而且它耐高溫、耐酒精消毒，利于實驗的無菌實施。使用自制的“U形金屬管”(錫鋁合金)進行壓管法活結結扎LAD，制備活體MI/R實驗模型，成功率很高。我們并行多項目以先進儀器檢測和綜合分析，評估模型相關合理的科學證據，特別是心電圖﹑心肌損傷標志物特異指標﹑左室心肌損傷區及梗死區的TTC染色和面積大小以及細胞凋亡率的測定，取得可靠的新結果。

我們還針對心肌凋亡用免疫組化法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達水平，與假結扎組﹑正常組比較，發現模型組Bcl-2/Bax蛋白比值明顯下降。已有研究表明：bcl-2基因是調控細胞凋亡信號途徑的重要基因，是一種細胞凋亡的抑制基因；而bax則是細胞凋亡的促進基因[8，9]。本實驗結果表明模型組Bcl-2/Bax蛋白比值逐漸下調，證明心肌細胞凋亡程度隨之增加。

總之，我們成功建立大鼠在體心肌缺血再灌注損傷實驗模型；利用多項指標檢測與綜合評價，充分證明缺血再灌注損傷明顯引起心肌細胞凋亡和梗死面積增加；明確了MI/R建模所需檢測的心電圖、病理生理學(免疫組化法、TUNEL法)和血清學等指標的檢測方法，為今后相關的實驗研究提供較可靠的參考依據。

[1] 王淑俠，蘭小莉，王吉文，等.大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型的改進與評價[J].解剖學進展，2000，6(4):371-373.

[2] 王顯剛，殷惠軍，史大卓.蒺藜總皂苷對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的影響[J].解放軍醫學雜志，2006，31(6):531-533.

[3] 陳孝平，石應康.外科常用實驗方法及動物模型的建立[M].第1版.北京:人民衛生出版社，2003.145-149.

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[5] Tsang A,Hausenloy DJ,Mocanu MM,et al. Postconditioning： a form of“modified reperfusion” protects the myocardium by activating the phosphatidy linositol 3-kinase-Akt pathway[J].Circ Res,2004,95(3):230-232．

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[7] Fu YH, Lin QX, Li XH, et al.A novel rat model of chronic heart failure following myocardial infarction[J]. Methods Find Exp Clin Pharmacol,2009,31(6):367-373.

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[9] Reed JC. Double identity for proteins of the Bcl-2 family [J]. Nature,1997,387(6635):773-776.

Establishmentandevaluationofratheartischemia-reperfusioninjurymodelinvivo

DENG Yu-jun1, FU Yong-heng3, TAN Ning2, ZENG Hong-ke1, SHAN Zhi-xin3, LIN Qiu-xiong3, LI Xiao-hong3, DONG Xiao-li2, YU Xi-yong3, YANG Min3, TAN Wei-ping4, SU Jian3

(1DepartmentofEmergencyandCriticalCare，2GuangdongCardiovascularInstitute，3ResearchCenterofMedicalSciences，4DepartmentofLibrary,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail:tanning100@126.com)

AIM: To establish and evaluate a rat model of heart ischemia-reperfusion injuryinvivo.METHODSSeventy-two male Sprague-Dawley rats weighing(250±50)g were randomly divided into sham operation group(sham), ischemia-reperfusion group(I/R) and normal group. The animals were anesthetized and heparinized. Myocardial ischemia-reperfusion was induced by ligating the left anterior descending coronary artery with “U-shape tube” for 35 min followed by 120 min or 240 min reperfusioninvivo. The heart infarct size was measured by triphenyltetrazolium chloride(TTC) staining. The myocardial cell apoptotic index was determined by the method of terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick-end labeling(TUNEL). Immunohistochemical method was used to detect the expression of Bcl-2 and Bax in rat ischemia myocardium. The blood level of MB isoenzyme of creatine kinase(CK-MB),cardiac troponin I(cTnI),nitric oxide(NO),malondialdehyde(MDA), total superoxide dismutase(T-SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px) were detected after reperfusion for 2 h and 4 h.RESULTSCompared with normal group and sham group, there were obvious changes of ST-T segment and Q wave in the electrocardiogram of I/R group. The blood level of CK-MB, cTnI, NO, MDA and GSH-Px in I/R group increased(P<0.05,P<0.01) after reperfusion for 2 h and 4 h, and the blood level of T-SOD in I/R group after reperfusion for 2 h and 4 h also increased(P<0.05). The heart infarct size in I/R group was the largest as compared to other groups. Among these groups, the apoptotic index of I/R group was the highest and the Bcl-2/Bax ratio in I/R group decreased(P<0.01).CONCLUSIONThe rat model of heart ischemia-reperfusion injuryinvivocan be successfully established with the “U-shape tube”. There are obviously changes of heart infarct size, blood level of CK-MB, cTnI, NO, MDA, T-SOD and GSH-Px, myocardial apoptotic index and Bcl-2/Bax ratio between I/R rats and control animals.

Rats; Reperfusion injury; Apoptosis

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-040

1000-4718(2011)02-0412-05

2010-10-08

2010-12-27

廣東省科技計劃資助項目(No.2008B030301166)；廣東省自然科學基金資助項目( No.9151008002000002)

△通訊作者 Tel：020-83827812；E-mail： tanning100@126.com