大鼠不同時(shí)期乳腺組織中雌激素孕激素及催乳素的變化規(guī)律

江青東，程會(huì)昌

（鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，河南 鄭州450011）

研究表明，雌激素在孕酮協(xié)同作用下，可增加乳腺細(xì)胞的孕酮受體數(shù)目，來(lái)促進(jìn)乳腺小葉腺泡的發(fā)育［1－5］。孕酮主要作用是促進(jìn)乳腺小葉及腺泡的發(fā)育，在雌激素刺激乳腺導(dǎo)管發(fā)育的基礎(chǔ)上，能使乳腺得到充分發(fā)育。催乳素主要作用是促進(jìn)乳腺發(fā)育、啟動(dòng)和維持泌乳［6－7］。在雌激素、孕激素及其他激素的共同作用下，促使乳腺發(fā)育；使乳腺小葉終末導(dǎo)管發(fā)展成為小腺泡，進(jìn)而為哺乳作準(zhǔn)備。同時(shí)隨著妊娠的進(jìn)行，催乳素與其受體的結(jié)合率增加，且可對(duì)其受體數(shù)量進(jìn)行調(diào)控，來(lái)促進(jìn)乳腺的發(fā)育及啟動(dòng)和維持泌乳。關(guān)于這3種激素相應(yīng)受體的研究報(bào)道較少，零星的研究主要集中在乳腺癌。本文在對(duì)不同時(shí)期大鼠乳腺組織中雌激素、孕激素和催乳素水平的變化進(jìn)行較系統(tǒng)試驗(yàn)，豐富動(dòng)物乳腺發(fā)育調(diào)控理論，為用神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控手段改善動(dòng)物泌乳提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 SD大鼠，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重250g。在12h光照和12h黑暗的條件下喂養(yǎng)，環(huán)境溫度20℃～25℃，自由采食和飲水。大鼠料購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。根據(jù)陰道涂片決定發(fā)情周期的不同階段，于發(fā)情前期處女鼠與雄性大鼠進(jìn)行同籠飼養(yǎng)（1∶2），雌雄合籠后次日上午在陰道涂片中發(fā)現(xiàn)精子者定為妊娠第1天（d1），妊娠鼠單個(gè)飼養(yǎng)，分別于6d，12d，18d處死大鼠；分娩的當(dāng)天看作泌乳0d，分別于6d，12d，18 d處死大鼠；另外處死處女鼠；每組6只。處死大鼠后取乳腺組織入液氮速凍，后置－80℃冰箱保存待測(cè)。

1.2 試劑和儀器 BSA蛋白、考馬斯亮藍(lán)G－250、乙醇、雌激素、孕激素及催乳素放免藥盒（購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所）；勻漿器、離心機(jī)、752紫外分光光度計(jì)，SN－695型智能放免γ測(cè)量?jī)x，液氮罐，－80℃冰箱等。

1.3 組織勻漿液的制備 取適宜大小的組織塊，立即稱重后于生理鹽水（1～2mL）中于勻漿器中制成勻漿，4℃，12 000r/min離心20min，取上清液置－20℃待測(cè)。

1.4 勻漿液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，考馬斯亮藍(lán)在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律 ，因此可以通過(guò)測(cè)定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取11支試管，按照表1依次加入試劑，搖勻，5min后測(cè)定各管OD595nm，并蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D595nm值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

未知樣品蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定：測(cè)定方法同上，取合適的未知樣品體積于2支干凈試管中，按上法測(cè)定OD595nm值，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)，根據(jù)所測(cè)定的OD595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

1.5 放免分析 雌激素、孕激素及催乳素放免試劑盒（由北京北方生物技術(shù)研究所提供）包括：標(biāo)準(zhǔn)品（S0－S6：0～4 000μIU/mL）、兔抗－Prl抗體、125IPrl、驢抗兔免疫分離劑組成。樣本采用雙管重復(fù)測(cè)定，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用γ－計(jì)數(shù)器測(cè)定沉淀cpm數(shù)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算勻漿液中雌激素、孕激素及催乳素的含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)勻漿液中蛋白質(zhì)濃度及放射免疫所測(cè)E2、P及Prl含量的結(jié)果，將樣本中E2、P及Prl的含量換算成pg/mg蛋白單位。所有數(shù)據(jù)均用X＋SD表示，并采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)，多組間比較用方差分析F檢驗(yàn)，組間兩兩比較用SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

乳腺組織中E2、P及Prl含量：不同時(shí)期大鼠乳腺組織中E2、P及Prl的含量見(jiàn)表2。

表2 不同時(shí)期大鼠乳腺組織中E2、P及Prl含量 （n＝6）

乳腺組織中：E2水平在處女期較高，分娩后，乳腺中E2水平又急劇升高，但整個(gè)泌乳期也呈逐漸下降趨勢(shì)，且維持在基本接近處女期水平。結(jié)果顯示，E2從處女期到整個(gè)妊娠期，其呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。而在分娩后E2水平急劇升高，后又有所下降，但維持在較高水平；P水平以處女期最高；隨著妊娠開(kāi)始，P水平逐漸下降，直至泌乳期18d降到最低。結(jié)果顯示，在乳腺發(fā)育的不同時(shí)期，P在乳腺組織中的整體水平一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；Prl水平以處女期最高；隨著妊娠的進(jìn)行逐漸降低。結(jié)果顯示，整個(gè)乳腺發(fā)育過(guò)程中Prl整體上幾乎一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

3 討論

成年動(dòng)物的乳腺一生中要經(jīng)歷發(fā)情周期中的增生和凋亡周期［8］。青春期雌激素可促進(jìn)乳腺導(dǎo)管發(fā)育，孕酮促進(jìn)乳腺腺泡的發(fā)育［9］。同時(shí)成年動(dòng)物乳腺在動(dòng)情期中的周期性生長(zhǎng)也需Prl起作用，以保證乳腺對(duì)雌激素和孕酮的反應(yīng)性［10］。從試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，雌激素在促進(jìn)乳腺發(fā)育及維持泌乳方面具有重要作用。青春期雌激素直接刺激導(dǎo)管發(fā)育，孕激素刺激上皮細(xì)胞DNA合成和腺泡發(fā)育［11－12］。本試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，隨著乳腺發(fā)育的不同時(shí)期，其E2的水平也發(fā)生了相應(yīng)的變化。且變化模式與理論報(bào)道一致。P在雌激素刺激乳腺導(dǎo)管發(fā)育的基礎(chǔ)上，它能使乳腺得到較為充分的發(fā)育。試驗(yàn)表明，切除垂體的去勢(shì)大鼠，其乳腺完全缺乏對(duì)孕酮的反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乳腺發(fā)育的不同時(shí)期，P的水平也發(fā)生了相應(yīng)的變化，尤其在妊娠期P水平明顯高于其余各時(shí)期，也充分體現(xiàn)了P在與其他激素相互作用下促進(jìn)乳腺發(fā)育和維持妊娠方面發(fā)揮了重要作用。且其變化模式與理論報(bào)道基本上一致。Prl在乳腺發(fā)育、啟動(dòng)泌乳和維持泌乳中都起著重要的作用，它協(xié)同卵巢類(lèi)固醇激素（E2和P4）促進(jìn)乳腺小葉腺泡的生長(zhǎng)和上皮細(xì)胞的增殖，妊娠末期，Prl通過(guò)發(fā)動(dòng)乳蛋白基因的表達(dá)來(lái)控制乳腺發(fā)育。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Prl水平在處女期和泌乳期變化基本一致，而在妊娠期變化不完全吻合此結(jié)論與理論報(bào)道呈負(fù)相關(guān)。

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