霍爾多巴吉鵝源小鵝瘟病毒VP3基因的克隆及序列分析

董 浩，段小波，單曉楓，胡桂學

（1.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春130118；2.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春130118）

小鵝瘟即鵝細小病毒?。╣oose parvovirus，GPV），是雛鵝和雛番鴨的一種急性或亞急性敗血性傳染病，主要侵害3～20日齡雛鵝和雛番鴨，以出血性、纖維素性滲出性腸炎為主要特征。該病傳染快，發病率和死亡率高，是嚴重危害養鵝業的重要傳染病之一?，F已證明，GPV基因組為單鏈、線性DNA，大小約為5.0kb，完整的病毒粒子呈六面體，無囊膜，含正鏈DNA和負鏈DNA的病毒粒子數目基本相等，兩種極性鏈很容易發生退火。其基因組含有兩個主要開放性閱讀框（ORF），右側ORF（RORF）編碼3種結構蛋白（VP），即 VP1、VP2、VP3，它們位于同一讀碼框，共用一個終止密碼子；左側ORF（LORF）編碼非結構蛋白（NS）。其中，VP3為主要結構蛋白，是病毒衣殼的主要成分，約占總蛋白量的80%，且暴露于病毒粒子表面，是病毒刺激集體產生保護性抗體的抗原蛋白［1］。

霍爾多巴吉白鵝具有個體大、體質健壯、抗病力強等特點，產絨率高、羽絨品質好，與當地普通白鵝相比具有明顯的優勢。近幾年，吉林省多個地區的鵝業公司從匈牙利引進霍爾多巴吉白鵝種蛋進行孵化，擴充商品鵝資源。本試驗采用的小鵝瘟GPV－H株是從吉林省某鵝廠病死的霍爾多巴吉雛鵝體內分離得到的［2］，本試驗主要通過對VP3基因的克隆和序列分析，了解本次發病的霍爾多巴吉雛鵝體內的小鵝瘟病毒的來源，為了解小鵝瘟的傳播途徑和防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株、毒株 大腸桿菌DH5α購于TaKa－Ra［寶生物工程（大連）有限公司］；小鵝瘟病毒GPV－H是從吉林地區某鵝廠病死的霍爾多巴吉雛鵝體內分離到。

1.2 引物 根據鵝細小病毒基因序列（GenBank登錄號為GPU25749）設計并合成了1對引物P1/P2，擴增全長GPV VP3基因片段1.6kb，由大連TaKaRa公司合成。斜體部分為酶切位點。

1.3 主要試劑 瓊脂糖購于格特蘭試劑公司；TaKaRa質粒小提試劑盒、TaKaRa膠回收試劑盒、限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ，T4連接酶；ExTaq酶，dNTP混合液，ExTag Buffer等購于TaKaRa［寶生物工程（大連）有限公司］。

1.4 小鵝瘟病毒核酸的提取 取GPV－H毒株鵝胚尿囊液500μL，經90℃水浴處理10min后，加入蛋白酶K（50μg/mL）和終濃度為1%SDS，56℃水浴40min，用等體積的酚/氯仿，氯仿依次抽提后，用乙醇沉淀核酸，70%乙醇漂洗，靜置風干后用TE緩沖液懸浮，－20℃保存備用。

1.5 VP3基因的擴增 以1.4提取的核酸為模板，以P1、P2為引物，擴增GPV－H目的基因。PCR反應體系如下：10×ExTaqBuffer，2.5μL；P1（20 pmol/μL），0.5μL；P2 （20pmol/μL），0.5μL；dNTP，2μL；模板DNA，2.5μL；四餾水，16.5μL；ExTaqTMDNA聚合酶，0.5μL。

PCR反應條件為：95℃預變性5min，94℃變性1min、54℃退火1min、72℃延伸2min，共30個循環；最后72℃徹底延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 VP3的PCR產物的克隆 按照TaKaRa公司膠回收試劑盒說明書進行操作，回收純化1.5產物目的片段，回收產物與pMD 18－T－simple載體相連接。連接體系為：Ligation solution I 5μL，pMD 18－T－simple 1μL，回收產物2μL，去離子水2μL，共10μL，混勻，16℃2h。

1.7 連接產物的轉化 取1.6中連接產物5μL轉入200μL大腸桿菌DH5α的感受態細胞中，冰浴放置30min，42℃熱激90s，再置冰浴中2min，加入100μL LB液體培養基，37℃，200r/min振搖1h后，按常規方法涂布于含有Amp（25μg/mL）的LB固體培養基平板上。37℃培養12～16h。

1.8 重組子的篩選與鑒定 挑取1.7平板上白色菌落若干個，接種至5mL含25μg/mL Amp的LB液體培養基中，37℃，200r/min培養過夜。按照質粒提取試劑盒操作步驟，對得到的菌液進行質粒提取。用BamHⅠ單酶切以及BamHⅠ和HindⅢ雙酶切進行鑒定。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。

1.9 重組質粒的測序與分析 將質粒酶切鑒定為陽性的菌液送往寶生物工程（大連）有限公司進行序列測定，采用DNAMAN軟件進行序列分析。參考序列見表1。

表1 參考毒株

2 結果

2.1 PCR擴增結果 根據VP3基因組序列設計的特異性引物，以小鵝瘟基因組DNA作模板，擴增出長度約為1 600bp的條帶（圖1）。

圖1 VP3基因擴增結果

2.2 重組質粒的篩選和酶切鑒定結果 用BamHⅠ和HindⅢ限制性內切酶對轉化子的質粒進行酶切鑒定，通過電泳，在1 600bp和2 700bp處得到兩條特異性條帶，見圖2。

圖2 重組質粒酶切鑒定結果1～3：轉化子質粒；4：λ－HindⅢdigest DNA Marker

2.3 GPV－H VP3基因序列分析結果 GPV－H株VP3基因測序結果顯示：基因全長為1 605bp，編碼534個氨基酸。與參考毒株的基因序列進行比較，結果發現，核苷酸同源性在92.5%～98.9%之間。通過DNAMAN軟件作出基因進化樹，分析表明，GPV－H株與波蘭和匈牙利分離到的5株病毒親緣關系較近（圖3）。

圖3 14株小鵝瘟病毒VP3基因進化樹分析

3 討論

本試驗克隆了鵝細小病毒GPV－H株的VP3基因，其序列與GenBank中發表的13株鵝細小病毒具有高度的同源性，達到了92.5%～98.9%，表明鵝細小病毒的VP3基因是高度保守的。這也表明用一種疫苗，可以防治大部分國內外野毒株的感染［3］。

本次試驗的發病鵝源為霍爾多巴吉白鵝，此種鵝原產地為匈牙利，近幾年，在吉林省常以種蛋形式被引進孵育，從基因進化樹結果表明，本試驗所分離到的GPV－H株與匈牙利、波蘭等歐洲地區報道的小鵝瘟基因序列親緣關系最近，極有可能是以種蛋帶毒方式，被引進到本省。

［1］ 賀云霞，王君偉，王立群，等.鵝細小病毒H1株VP2基因的克隆和序列分析［J］.中國預防獸醫學報，2003，25（5）：330－333.

［2］ 董浩，馬磊，單曉楓，等.霍爾多巴吉白鵝小鵝瘟病毒的分離與鑒定［J］.中國獸醫雜志，2010，46（10）：49－50.

［3］ Karsten Hueffer.The natural host range shift and subsequent evolution of canine parvovirus resulted from virus－specific binding to the canine transfer in receptor［J］.Journal of Virology，2003，2：1718－1726.