槲皮素固體脂質納米粒的包封率與載藥量測定Δ

常明泉，黃良永，葉立紅，袁勝浩，安志斌，王剛（湖北醫藥學院附屬太和醫院，十堰市442000）

槲皮素固體脂質納米粒的包封率與載藥量測定Δ

常明泉＊，黃良永，葉立紅，袁勝浩，安志斌，王剛#（湖北醫藥學院附屬太和醫院，十堰市442000）

目的：建立槲皮素固體脂質納米粒（SLN）的包封率和載藥量測定方法。方法：采用高速離心-高效液相色譜法。色譜柱為DiamonsiL-C18（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-4.3%乙酸溶液（55∶45），流速為1.0mL·min-1，檢測波長為254nm，柱溫為30℃。結果：槲皮素檢測濃度在2.0～200.0μg·mL-1范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系（r＝0.9996）；平均回收率為97.83%，RSD＝1.03%（n＝6）。該條件下，槲皮素SLN的包封率為80.2%，載藥量為1.7%。結論：所建方法便捷、可靠，可用于SLN包封率與載藥量的測定。

槲皮素；固體脂質納米粒；包封率；載藥量

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，它在一些植物藥如蘆丁、槐米、紅棗、桑葉、三七中以苷的形式存在；它通過細胞增殖和血管新生相關信號通路的復雜作用而對腫瘤表現出化學預防作用[1]。固體脂質納米粒具有細胞親和性、靶向性、緩釋性、低毒性和穩定性的特點，藥物制成脂質體可大大提高生物利用度[2]。槲皮素固體脂質納米粒是十堰市武當中醫藥研究所研制的一種抗癌新制劑，為了更好地發揮槲皮素的藥理作用，控制制劑質量，筆者擬用高速離心機和高效液相色譜（HPLC）法對其包封率和載藥量進行測定。

1 儀器與試藥

TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪子華儀器制造廠）；UPS-200H型超聲波震蕩儀（功率：500W，工作頻率：50Hz，南京熊貓電子儀器有限公司）；3000型HPLC儀（美國戴安公司）。

槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100081-200406）；槲皮素原料（十堰市武當中醫藥研究所，批號：20100414）；山崳酸甘油酯、大豆卵磷脂、膽固醇、泊洛沙姆、聚乙二醇2000（武漢祥和精細化工有限公司，批號分別為100305、100310、100305、100315、100307）；丙酮（武漢市江北化學試劑廠，批號：20080407）；氯仿（洛陽化學試劑廠，批號：20080224）；吐溫80（上海化學試劑廠，批號：20081006）；無水乙醇（武漢市洪山中南化學試劑有限公司，批號：20091106）；甲醇、乙酸均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 槲皮素固體脂質納米粒的制備[3]

分別稱取山崳酸甘油酯0.1g、膽固醇0.1g、大豆卵磷脂0.2g置適宜燒杯中，于80℃水浴中熔融作為油相；稱取丙酮6mL、氯仿6mL混勻，再稱取槲皮素20mg加入丙酮-氯仿混合液中混合溶解作為有機相；將有機相與油相混合均勻，保溫75℃；稱取泊洛沙姆0.1g、聚乙二醇20000.1g、吐溫801mL、純化水13mL置適宜燒杯中，于75℃水浴上加熱溶解作為水相；在磁力攪拌狀態下（600r·min-1）用帶有6號針頭的適宜注射器吸取油相緩緩注入水相中（2mL·min-1），繼續攪拌120min乳化包封，至濃縮到原體積的1/2時，將燒杯移入另一盛有2℃冰水的磁力攪拌器中，加入13mL約2℃的冰水，繼續攪拌固化60min，即得。

2.2 槲皮素固體脂質納米粒包封率與載藥量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱：DiamonsiL-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-4.3%乙酸溶液（55∶45）；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：254nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL[4～7]。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取于105℃減壓干燥至恒重的槲皮素對照品2.0mg，加無水乙醇超聲溶解，定容至10mL的容量瓶中，即得。

2.2.3 樣品溶液的制備 （1）樣品溶液A的制備：取槲皮素固體脂質納米粒樣品1g，精密稱定，置50mL平底燒杯中，加無水乙醇約15mL超聲破乳分散均勻，溶液轉入50mL容量瓶中，洗滌燒杯3次（10、10、10mL），洗液并入容量瓶中，定容，搖勻，取混合溶液適量于離心機中以1.6×104r·min-1的速度離心15min，取上清液用0.45μm微孔濾膜過濾，即得。（2）樣品溶液B的制備：取同一批號樣品1g，加入15mL純化水，按上述方法用同體積的純化水處理樣品，即得。（3）陰性樣品溶液的制備：按樣品溶液A的方法精密稱取不含槲皮素的陰性樣品1g，加入無水乙醇照上述方法處理，即得。

2.2.4 標準曲線的制備 分別吸取槲皮素對照品溶液0.1、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL至10mL容量瓶中，用甲醇稀釋，即得2、40、80、120、160、200μg·mL-1的對照品溶液，精密吸取 20μ L進樣，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，重復操作3次。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，檢測濃度（c）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝1.3435c－1.4904（r＝0.9996，n＝6）。結果表明，槲皮素檢測濃度在2.0～200.0μg·mL-1范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.2.5 系統適用性試驗 分別吸取對照品溶液和各樣品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣。結果，對照品溶液、樣品溶液A、樣品溶液B均在相同位置有吸收峰出現，陰性樣品溶液則無吸收，說明其他輔料對槲皮素測定不產生干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.樣品溶液A；C.樣品溶液B；D.陰性樣品溶液；1.槲皮素Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.sample solution A；C.sample solution B；D.negative sample solution；1.quercetin

2.2.6 精密度試驗 取濃度為80μg·mL-1的對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣5次，測定槲皮素的峰面積。結果，RSD＝1.12%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 取取已知含量的樣品溶液適量，于溫度為5～10℃的冰箱中保存，分別于0、4、12、24、36、48h取樣，進樣測定槲皮素的含量。結果，RSD＝1.62%（n＝6），表明供試品溶液在48h內穩定。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已測知含量的槲皮素固體脂質納米粒樣品6份，每份0.5g，精密稱定，分別加入濃度為80.0μg·mL-1的對照品溶液1mL，按“2.2.3”項下方法制備樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，測定槲皮素的含量，計算加樣回收率。結果，平均回收率為97.83%，RSD＝1.03%（n＝6）。

2.2.9 重復性試驗 平行稱取6份樣品，各1g，按“2.2.3”項下方法制備樣品溶液，照上述色譜條件進樣測定。結果，RSD＝1.80%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.2.10 包封率的測定 在“2.2.1”項色譜條件下，分別對樣品溶液A和樣品溶液B進樣測定槲皮素的含量，可以計算出納米粒中槲皮素的總量和游離槲皮素的量，按下式計算出納米粒的包封率：包封率＝（W總－W游）/W總×100%（式中，W總為脂質體中槲皮素總量；W游為脂質體中未被包封的游離槲皮素量）。測得該制劑包封率為80.2%。

2.2.11 載藥量的測定 按上述方法，分別測定出樣品溶液A和樣品溶液B中槲皮素的含量，按下式計算載藥量：載藥量＝（W包－W游/V總重）×100%（式中，V總重為納米粒取樣量；W包為脂質體中被包封的槲皮素量；W游同前）。測得該制劑的載藥量為1.7%。

3 討論

本試驗采用乳化蒸發-低溫固化法制備槲皮素固體脂質納米粒，主藥槲皮素不溶于水，先將其加入丙酮-氯仿（1∶1）組成的有機相中溶解后再加入油相中混合，加入2.5%的吐溫80作乳化劑，以山崳酸甘油酯、膽固醇為載體材料，乳化溫度控制在75℃，乳化和固化時攪拌器轉速均控制在600r·min-1，制得的脂質納米粒穩定性好，并有較高的包封率。

本試驗采用高速離心-HPLC法測定固體脂質納米粒的包封率和載藥量，在處理樣品溶液A時，加入無水乙醇超聲不僅能夠破乳而且使槲皮素被乙醇充分溶解；處理樣品溶液B時，在樣品中加入純化水，超聲分散、洗脫未被包封的槲皮素，超聲時間應控制在15～30min內，時間過久超聲波的空化效應由于對粒子的粉碎作用會使納米粒中的槲皮素破乳而游離，影響測定結果。

[1] 舒 毅，譚 陶，張思宇，等.槲皮素的藥理學研究進展[J].華西藥學雜志，2008，23（6）：689.

[2] 崔福德.藥劑學[M].第6版.北京：人民衛生出版社，1980：421-426.

[3] 張 紅.柚皮苷固體脂質納米粒包封率及體外釋放度測定[J].中國藥師，2010，13（3）：318.

[4] Pugund LN，Enge LA，Vandhana RS，et al.Switchgrass water extracts：extraction，separation and biological activity of rutin and quercetin[J].J Agric Food Chem，2009，57（17）：7763.

[5] 樂文清.HPLC法測定丹皮酚脂質體藥物含量與包封率[J].安徽醫藥，2010，14（4）：417.

[6] 鄭慶中，劉利軍，白曉朝.氧化苦參堿脂質體的制備及其質量評價[J].中國藥房，2007，18（10）：756.

[7] 黃義昆，張志榮，杜 鵑.鹽酸川芎嗪脂質體的研制及質量評價[J].中國藥房，2004，15（6）：51.

Determination of Drug-loading Rate and Encapsulation Efficiency of Quercetin Solid Lipid Nanoparticles

CHANG Ming-quan，HUANG Liang-yong，YE Li-hong，YUAN Sheng-hao，AN Zhi-bin，WANG Gang（Taihe Hospital of Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China）

OBJECTIVE：To establish the determination method of the drug-loading rate and encapsulation efficiency of Quercetin solid lipid nanoparticles（QUE-SLNs）.METHODS：A high-velocity centrifuge-HPLC was adopted.The determination was performed on DiamonsiL-C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-4.3%acetic acid solution（55∶45）at flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 254nm and column temperature was 30℃.RESULTS：The linear range of quercetin was 2.0～200.0μg·mL-1（r＝0.9996）with an average recovery of 97.83%（RSD＝1.03%，n＝6）.The encapsulation efficiency of QUE-SLNs was 80.2%and the drug-loading rate was 1.7%.CONCLUSION：The method is simple，convenient and reliable.It can be used for the determination of drug-loading rate and encapsulation efficiency of SLN.

Quercetin；Solid lipid nanoparticles；Encapsulation efficiency；Drug-loading rate

R284.2；R283.62

A

1001-0408（2011）27-2525-02

Δ湖北省教育廳科研項目（Q20102110）

＊主管藥師。研究方向：藥物制劑。電話：0719-8801103。E-mail：cmqman@yahoo.com.cn

#通訊作者：副主任藥師，博士。研究方向：中藥藥理。E-mail：wangan139@163.com

2010-11-03

2011-04-10）