豬苓及豬苓多糖對BBN聯合糖精作用Fisher-344大鼠肝臟代謝酶的影響

張國偉，李彩霞，王艷峰，黃 羽，蘇芝軍，鄭 芳，曾 星*

1河北大學中醫學院，保定071002;2廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣州510006; 3中國醫藥集團四川抗菌素工業研究所，成都610051;4陜西省府谷縣人民醫院，府谷719400

豬苓及豬苓多糖對BBN聯合糖精作用Fisher-344大鼠肝臟代謝酶的影響

張國偉1，李彩霞2，王艷峰3，黃 羽2，蘇芝軍4，鄭 芳2，曾 星2*

1河北大學中醫學院，保定071002;2廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣州510006;3中國醫藥集團四川抗菌素工業研究所，成都610051;4陜西省府谷縣人民醫院，府谷719400

以BBN聯合糖精作用Fisher-344大鼠，分別使用ELISA及RT-PCR方法測定樣本中CYP450、GST和NQO1酶活性及Gstpi和NQO1 mRNA相對表達含量。結果表明，豬苓及豬苓多糖均可使樣本中CYP450酶活性顯著降低，其中豬苓對CYP450酶活性抑制呈劑量依賴性;豬苓及豬苓多糖對樣本中GST無明顯影響，豬苓可顯著升高樣本中NQO1酶活性;豬苓高劑量及豬苓多糖可上調GSTPi mRNA表達，豬苓及豬苓多糖對NQO1 mRNA表達無明顯作用。研究表明豬苓及豬苓多糖抗癌作用與降低CYP450與升高NQO1酶活性有關，但機制有待進一步研究。

豬苓;豬苓多糖;細胞色素P450;Ⅱ相代謝酶

豬苓及豬苓多糖對N-丁基-N-(4-羥丁基)亞硝胺(BBN，N-butyl-N-(4-hydroxy--butyl)-nitrosamine)聯合糖精(Saccharin)誘導大鼠膀胱癌具有顯著的預防作用，其預防作用與上調實驗鼠膀胱組織中Ⅱ相酶谷胱甘肽轉移酶-π(GSTPi，glutathione S-transferase-π)和NADP(H)醌氧化還原酶(NQO1，NAD(P) H:quinone oxidoreductase 1)有關［1］。本文研究豬苓及豬苓多糖對BBN聯合糖精作用大鼠肝臟中代謝酶細胞色素P450(CYP450，cytochrome P450)、谷胱甘肽轉移酶(GST，glutathione S-transferase)、NQO1活性及GSTPi、NQO1mRNA表達作用。

1 材料、試劑與儀器

豬苓，江陰天江藥業有限公司，每克相當于10克生藥，用前按劑量溶于生理鹽水;豬苓多糖，廣東華南藥業集團有限公司，用前按劑量溶于生理鹽水; BBN，日本TCI株式會社;糖精，上海第六制藥廠。Trizol，Invitrogen，Carlsbad，CA;PrimescriptTM RT reagent，SYBP Premix Ex TaqTM，TAKARA;氯仿、異丙醇及無水乙醇均為新開瓶分析純。

PCR儀，ABI 7500 Real Time PCR System;UV-4000紫外可見分光光度計，Pharmacia Biotech公司;電泳儀，BIO-RAD;BIO-RAD Gel Dox XR凝膠成相系統。

2 實驗動物及分組

雌性Fisher-344大鼠60只，7周齡，購于北京維通利華實驗動物有限公司，實驗開始前實驗動物前于實驗環境中適應3 d。實驗動物給予含0.05% BBN飲用水階段于廣東醫學實驗動物中心進行，給予供試物階段于廣東省中醫藥科學院動物房進行。動物實驗遵守廣東省中醫院實驗動物倫理規范，動物飼養環境，溫度為23±2℃，濕度為55±5%，12 h/12 h白晝交替，自由飲水，標準飼養飼料。

圖1 實驗動物分組及造模示意圖Fig.1 Experimental animal groups and bladder cancer model establishment

將大鼠隨機分為6組，每組10只，即生理鹽水組，模型組，豬苓多糖組(130 mg/kg)，豬苓50 mg/ kg組，豬苓250 mg/kg組和豬苓500 mg/kg組。除生理鹽水組外，其它5組實驗大鼠從實驗開始到第8周給予含0.05%BBN的飲用水;第8周后，實驗大鼠開始給予含5%糖精的飲用水，至第20周截止;從第9周開始給予豬苓及豬苓多糖供試物，劑量為1 ml/100 g，給藥至實驗結束為止［圖1］。實驗結束后，所取肝臟組織于-80℃凍存。

3 方法

3.1 CYP450、GST和NQO1酶活性測定

3.1.1 肝臟樣本的制備

切取并稱量大鼠肝臟約100 mg，加入一定量4℃預冷PBS中，電動勻漿器6000～8000 r/min勻漿30 s，制備成5%勻漿液，10000 g離心30 min，分離上清，置于-80℃保存。

3.1.2 酶活性測定

標準品依次濃度為360、240、120、60、30、15 mIU/L。以酶聯免疫法測定大鼠肝臟組織中各酶活性，測定波長為450 nm。

3.2 肝臟Gstpi和NQO1 mRNA相對表達含量總RNA制備及RT-PCR實驗

取適量肝臟組織，置于0.01%DEPC處理過的玻璃勻漿器中，加入1 mlTRIZOL后于冰浴上勻漿，得TRIZOL勻漿液后，每1 mLTRIZOL加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩30 s后靜置15 min，之后12000×g在4℃離心15 min，取上層清液，加入0.5 mL異丙醇，上下顛倒搖晃均勻后室溫放置10 min，后12000 ×g在4℃離心10 min，棄去上清，加入0.8 mL以無水乙醇配制的75%乙醇，輕輕敲打后8000×g在4℃離心10 min，洗滌2次，之后棄去酒精，將EP管置于通風廚中吹干酒精，加入20μL Rnase/Dnase水，吹打數次，溶解后取出10 μL，加入590 μL滅菌水中，以UV4000測定RNA純度及濃度。根據所測定RNA濃度使用TAKARA公司PrimescriptTM RT reagent依據使用說明反轉錄得到 cDNA，加入總RNA量為1 μg，反應體系為20 μL，并使用TAKARA公司SYBP Premix Ex TaqTMⅡ進行熒光定量PCR實驗，實驗使用儀器為ABI 7500 Real Time PCR System，擴增條件為95℃ 5 s，60℃34 s，40個循環。

引物:

Gstpi sense，AATGCCATCTTGAGGCACCTG;antisense，ATGAGGGTACCATATTTGCATCGAA;

NQO1 sense，TGGAAGCTGCAGACCTGGTG;an-tisense，TTGTCATACATGGTGGCATACGTG;

引物設計由GeneBank得到序列后設計，Gstpi，NM_012577.2，NQO1，NM_017000.3;產物擴增長度為:Gstpi-125 bp，NQO1-130 bp，β-actin-150 bp。

3.3 統計方法

實驗結果以means±S.D.表示，以Dunnett's t test方法評價數據統計性差異，P＜0.05為有顯著統計性差異。

4 結果

4.1 豬苓及豬苓多糖對實驗大鼠肝臟CYP450、GST及NQO1酶活性測定

與正常組比較，豬苓多糖及豬苓50、250和500 mg/kg給藥組肝臟微粒體中CYP450和GST酶活性明顯降低，差異非常顯著(P＜0.01);豬苓多糖及豬苓50和250 mg/kg給藥組肝臟微粒體中NQO1酶活性明顯升高，差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 大鼠肝臟CYP450、GST及NQO1酶活性Table 1 Quantification of Liver CYP450，GST，NQO1 by ELISA assay in each group.

4.2 豬苓及豬苓多糖對實驗大鼠肝臟 GSTPi，NQO1 mRNA相對表達含量

與正常組比較，豬苓多糖組及豬苓500 mg/kg組實驗大鼠肝臟GSTPi mRNA相對表達含量上調，差異顯著(P＜0.05);其它各組GSTPi及NQO1 mRNA表達均無顯著性差異。

表2 大鼠肝臟GSTPi，NQO1相對表達含量Table 2 Quantification of Liver GSTPi，NQO1 expression by RT-PCR assay in each group

5 討論

接觸和攝入環境中的各種化學致癌物，如苯并芘、黃曲霉素、有機氯磷農藥以及亞硝胺化合物等，是引發各種癌癥的主要原因。化學致癌物多為脂溶性，從細胞和機體中清除的前提是必須提高其親水性，該過程可分為Ⅰ期和Ⅱ期。首先經Ⅰ相代謝酶如細胞色素P450作用后，在疏水的化學致癌物中引入羥基;接著在肝臟Ⅱ相代謝酶如GST、NQO1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UGT)等的作用下，在已產生的羥基上再糖基化，進一步提高化合物的水溶性而促進其排出體外［2］。與Ⅰ相酶不同，Ⅱ相代謝酶的誘導不會增加致癌風險，因此誘導Ⅱ相代謝酶的活性是化學防癌的關鍵步驟［3，4］。

對細胞色素P450系的調控作用，在藥物相互作用上扮演著至關重要的角色。從對細胞色素P450酶活性的影響看，豬苓多糖及豬苓均可使P450酶活性顯著降低，其中豬苓對P450酶活性的抑制呈劑量依賴性。豬苓多糖為豬苓中降低P450酶活性的主要成分，其它成分有無降低P450酶活性作用及豬苓及其主要成分抑制P450酶活性具體亞型還有待深入研究。

Ⅱ相代謝酶主要有GST、NQO1等。流行病學研究證實Ⅱ相酶GST和NQO1的缺失或下降與人類膀胱癌發病風險密切相關［5-8］，敲除小鼠GSTPi和NQO1可誘導腫瘤［9-11］，二者在預防膀胱癌形成的過程中起到重要作用［7，12］。

誘導Ⅱ相代謝酶的活性是化學防癌的關鍵步驟。實驗中，豬苓對可使NQO1酶活性顯著降低，但高劑量豬苓卻未對肝臟NQO1酶活性產生明顯影響，說明此劑量下豬苓對肝臟NQO1酶活性無明顯作用;豬苓多糖對肝臟NQO1酶活性也無明顯作用。從模型組GST酶活性可以推測，BBN及糖精誘導性Fisher-344大鼠肝臟GST酶活性顯著下降，實驗中豬苓多糖及豬苓各劑量組均不能明顯增加GST酶活性，與模型組比較，肝臟GST酶活性無顯著差異，可推測豬苓多糖及豬苓對實驗大鼠肝臟GST酶活性影響不大。

豬苓多糖及豬苓500 mg/kg有明顯上升實驗大鼠肝臟GSTPi mRNA相對表達含量作用，其它各組GSTPi mRNA相對表達含量與正常組比較未見明顯作用。豬苓多糖組及豬苓各劑量組對大鼠肝臟NQO1 mRNA相對表達含量未見有明顯作用。

GSTPi為GST酶系統中與膀胱癌發生密切相關的亞型酶，實驗中豬苓多糖及豬苓500 mg/kg可明顯上調 GSTPi mRNA表達，此結果與 GST總酶ELISA結果不同，顯示豬苓多糖及豬苓高劑量可上調GSTPi mRNA表達，但對GST酶整體活性無明顯作用。同樣，與ELISA方法測定豬苓多糖及豬苓對實驗鼠肝臟NQO1結果不同，豬苓多糖及豬苓對NQO1 mRNA表達無明顯作用，結果暗示二者還有可能通過其它途徑影響NQO1酶活性。

豬苓可顯著降低大鼠肝臟CYP450酶活性，豬苓對CYP450酶活性呈劑量性依賴作用，豬苓中豬苓多糖為抑制CYP450酶活性成分之一;豬苓高劑量及豬苓多糖能升高GST亞型GSTPi活性，對總的GST酶活性影響并不明顯;豬苓中低劑量可上升大鼠肝臟NQO1酶活性，豬苓多糖并無此作用，全部劑量豬苓對NQO1 mRNA無明顯影響，豬苓對NQO1的升高作用可能還通過其它途徑。

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Effects of Aqueous Extract of Sclerotia of Polyporus umbellatus and Polyporus Polysaccharide on Liver Metabolic Enzyme of Fisher-344 Rats Induced by BBN Combined Saccharin

ZHANG Guo-wei1，LI Cai-xia2，WANG Yan-feng3，HUANG Yu2，SU Zhi-jun4，ZHENG Fang2，ZENG Xing2*1College of Chinese Medicine，Hebei University，Baoding 071002，China;2Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China;3Sinopharm ChuanKong pharmaceutical CO.，LTD，Chengdu 610051，China;4Fugu Peoples Hospital of Shanxi，Fugu 719400，China

The present aimed to evaluate effects of sclerotia of P.umbellatus FRIES aqueous extract(SPUE)and Polyporus polysaccharide(PPS)on liver metabolic enzyme of Fisher-344 rat induced by N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine(BBN)combined saccharin.The rat liver enzyme activities of CYP450，glutathione S-transferase(GST)，and NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1(NQO1)were determined by ELISA.The relative expressions of liver glutathione S-transferase π(GSTPi)and NQO1 mRNA were measured with RT-PCR.The present report showed the SPUE and PPS decreased the activity of rat liver CYP450 enzyme，the effect had dose-effect relationship;they had no significant effect on the activity of rat liver GST enzyme，and they could increase the activity of rat liver NQO1 enzyme;the high dose SPUE could up-regulate the GSTPi mRNA relative expression in rat liver，they had no effect on the NQO1 mRNA relative expression in rat liver.In conclusion，the inhibition of bladder carcinogenesis by SPUE and PPS associate with the decreasing of rat liver CYP450 enzyme activity and increasing of NQO1 enzyme activity，but the mechanism needs further research.

sclerotia of Polyporus umbellatus;Polyporus polysaccharide;CYP450;Ⅱphase enzyme

1001-6880(2011)05-0923-04

2010-08-23 接受日期:2010-12-13

廣東省科技計劃項目(2010B030700059);河北大學科研基金資助項目(2101Q46);河北省衛生廳科研基金項目(20110514)

*通訊作者 Tel:86-20-39318678;E-mail:zengxing-china@163.com

R285.5

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