黑莓果渣中花色苷的提取工藝研究

李 立，劉曄瑋，岳 雄，李 麗，彭 倩，邸多隆

1蘭州大學公共衛生學院營養與食品衛生研究所;2中國科學院蘭州化學物理研究所中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室;3蘭州大學公共衛生學院流行病與衛生統計學研究所，蘭州730000

黑莓果渣中花色苷的提取工藝研究

李 立1，2，劉曄瑋1*，岳 雄3，李 麗1，2，彭 倩1，邸多隆2*

1蘭州大學公共衛生學院營養與食品衛生研究所;2中國科學院蘭州化學物理研究所中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室;3蘭州大學公共衛生學院流行病與衛生統計學研究所，蘭州730000

通過提取方法優選，表明超聲法對黑莓果渣中花色苷的提取效果最佳。以60%乙醇為超聲法提取溶劑，通過單因素實驗分別考察了料液比、超聲時間、溫度、功率、提取次數對提取黑莓果渣中花色苷的影響。綜合單因素實驗結果，通過響應面法篩選出最佳的工藝條件為:液料比14∶1(mL∶g)，時間40 min，溫度58℃，功率300 W，提取2次。通過提取物中花色苷含量與其清除DPPH·活性的相關性分析發現，黑莓果渣提取物清除DPPH·活性與其花色苷含量之間存在相關性，由此推斷花色苷為黑莓果渣中主要的自由基清除物質。

黑莓果渣;花色苷;提取;響應面法;自由基

黑莓(Blackberry)為薔薇科懸鉤子屬植物，果實中含有豐富的花色苷類物質，是一種很好的天然食用色素，同時也是抗氧化劑和自由基清除劑的天然來源［1，2］。工業生產中一般榨其果汁主要用于制作甜點、果醬、果凍、果酒和飲料等［3］，而在榨汁加工中會產生大量的殘渣，除黑莓籽可以用于榨油外，一般將果渣部分直接廢棄，這不僅造成資源浪費，也會污染環境。因此，有必要對黑莓果渣中花色苷進行提取，這對于有效利用黑莓具有重要意義。趙慧芳等人以色價和含量為評價指標，通過傳統的正交實驗方法對黑莓果實中花色苷提取工藝進行篩選，確定了以1%HCl-甲醇為溶劑提取黑莓果實花色苷的最佳提取方法，同時證明黑莓果實色價和總花色苷含量具有極顯著的正相關性［4］。但是，甲醇對于中樞神經系統、視神經及視網膜的毒性，做為提取溶劑提取天然產物中有效成分時，其溶劑殘留一直是食品、保健品工業高度關注的問題。作者在前期的研究工作中，通過評價黑莓果渣不同極性溶劑提取物抗氧化活性，篩選出60%乙醇為提取黑莓果渣中抗氧化物質的最佳溶劑。響應面法已被廣泛應用于優化天然產物中有效成分提取工藝條件的研究，響應面法可使各因素的交互作用通過有限次實驗來評估，是一種優化加工條件的有效方法［5-7］。

本研究在前期研究工作基礎上，通過單因素實驗、響應面法篩選出最佳的工藝條件，并進一步探討了黑莓果渣中抗氧化活性物質基礎，為工業生產中更好地利用黑莓果渣提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

BT224S分析天平(Sartorius公司)，KQ-500DB數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DZF-6050真空干燥箱(鞏義市英峪予華儀器廠)，T6新世紀紫外-紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

1，1-二苯基-2-苦肼自由基(DPPH·)標準品(購自Sigma公司，批號:S43654-098)，雙重蒸餾水(實驗室自制)，乙醇、甲醇、濃鹽酸、氯化鉀、醋酸鈉等均為分析純。

黑莓果渣由南京新得力食品有限公司提供，低溫避光保存，臨用前取出，放至室溫。

1.2 實驗方法

1.2.1 花色苷含量測定方法［8，9］

取黑莓果渣提取物溶液，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖溶液稀釋后，以緩沖溶液作空白，在500～900 nm波長范圍下進行吸收光譜掃描，確定最大吸收峰為510 nm，故選定510 nm和700 nm作為示差法測定黑莓果渣提取溶液中花色苷的吸收波長。

精密量取黑莓果渣提取物溶液各1 mL，分別用pH 1.0(0.2 mol/L KCl:0.2 mol/L HCl=25∶67(v/ v))和pH4.5(1 mol/L NaAc:1 mol/L HCl:H2O= 100∶60∶90(v/v))的緩沖液稀釋并定容至10 mL，靜置2 h后，分別在510 nm和700 nm處測定吸光值，總花色苷的含量(ACY)(以矢車菊色素-3-葡萄糖苷計)按下式(1)計算:

其中:V-提取液總體積(mL);m-取樣量(g);

26900-矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數;

449.2 -矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾分子質量。

1.2.2 清除DPPH·活性測定［10］

DPPH·標準液制備:用甲醇配制濃度為0.054 mg/mL的DPPH·標準品儲備液，臨用時將儲備液稀釋至0.027 mg/mL的標準溶液。

精密量取樣品溶液2 mL，加入2 mL DPPH·標準溶液，使總體積為4 mL，即為樣品反應溶液。精密量取60%乙醇2 mL，加入DPPH·標準溶液2 mL，使總體積為4 mL，即為空樣溶液。精密量取2 mL樣品溶液，加入2 mL甲醇，使總體積為4 mL，即為空白溶液。分別將樣品反應溶液、空樣溶液和空白溶液混均后，在室溫避光反應30 min后，在517 nm波長處測定吸光值，得到A樣品、A空樣和A空白。按下式(2)計算樣品對DPPH·清除率。

1.2.3 提取方法考察

分別考察回流提取法、超聲提取法、恒溫循環提取法對黑莓果渣中花色苷的提取效果的影響，提取條件如下:

回流法:黑莓果渣2.00 g，加60%乙醇20 mL，回流提取1 h，過濾，濾液定容至200 mL，備用。

超聲提取法:黑莓果渣2.00 g，加60%乙醇20 mL，超聲提取1 h(140 W，40℃)，過濾，濾液定容至200 mL，備用。

恒溫循環提取法:黑莓果渣2.00 g，加60%乙醇20 mL，恒溫循環提取1 h(40℃)，過濾，濾液定容為200 mL，備用。

將上述提取液按照“1.2.1”測定方法測定提取液中花色苷含量。

1.2.4 單因素實驗

以單因素實驗分別考察超聲溫度(30～70℃)、超聲時間(10～60 min)、超聲功率(200～500 W)、超聲次數(1～3次)和液料比［6∶1～22∶1(mL∶g)］等因素對黑莓果渣中花色苷提取效果的影響。

1.2.5 響應面法優化實驗設計

根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理，在單因素實驗的基礎上，選取超聲溫度、提取時間、超聲功率進行3因素3水平響應面實驗設計(見表1)，優化黑莓果渣花色苷提取條件。應用MiniTab計算機軟件對所得數據進行多元回歸擬合分析。

表1 響應面設計各因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.6 花色苷含量與清除自由基活性相關性分析

隨機選取響應面實驗設計提取的4個提取溶液，分別測定其花色苷含量和DPPH·清除活性，比較分析花色苷含量與清除自由基活性之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 最佳檢測波長的選擇

在花色苷分光光度法測定中，為了消除其它物質的干擾，根據花色苷在不同pH值環境結構發生變化，而干擾物質吸收光譜不隨pH變化的特征，一般采取示差測定法。示差法是分別用兩種不同pH值的緩沖溶液來稀釋待測液，然后計算不同pH溶液吸光度差值的測定方法，通常選用的pH為1.0和4.5(光譜掃描如圖1)。本實驗選定510 nm和700 nm兩個波長進行測定。

圖1 黑莓花色苷在pH1.0和4.5緩沖液中吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of blackberry anthocyanins in pH1.0 and 4.5 buffer solution

2.2 不同提取方法花色苷含量比較

分別用回流提取法、超聲提取法、恒溫循環提取法提取黑莓果渣中花色苷，黑莓果渣中花色苷含量測定結果見表2。經方差分析:各處理組間均數差別存在統計學差異(P=0.000＜0.05)，超聲輔助提取效果最佳。

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 溫度對花色苷提取的影響

考察在液料比為10∶1，提取時間為30 min，功率為140 W的條件下，溫度對60%乙醇提取黑莓果渣中花色苷的影響。由圖2知:隨著溫度的升高，花色苷的提取率相應增加。當溫度達到50℃時，花色苷提取率達到最大值，隨后逐漸減低。這是因為升溫能提高花色苷的溶解度和擴散速度，同時有助于細胞的破壞，從而使花色苷類物質易于從細胞內釋出。但當溫度超過某一熱敏臨界值時，反而會使花色苷降解，從而導致提取率降低［11］。

表2 不同方法提取黑莓果渣花色苷含量(mg/100 g)Table 2 The content of anthocyanins with different extraction methods(mg/100 g)

圖2 溫度對花色苷提取的影響Fig.2 Efect of the temperature on the total anthycanin content

2.3.2 液料比對花色苷提取的影響

考察在溫度為40℃，提取時間為30 min，功率為140 W的條件下，液料比對60%乙醇提取黑莓果渣中花色苷的影響。由圖3可知，在液料比在6∶1～22∶1(mL∶g)范圍內，花色苷含量隨著液料比的增加而增加。但當達到14∶1后其增加幅度放緩。從節約成本方面考慮，繼續增加液料比會導致提取成本增加，故選擇14∶1(mL∶g)作為最佳提取的料液比。

圖3 液料比對花色苷提取的影響Fig.3 Efect of the ratio of solid to solvent on the total anthycanin content

2.3.3 提取時間對花色苷提取的影響

考察在液料比為10∶1，超聲溫度為50℃，功率140 W的條件下，提取時間對60%乙醇提取黑莓果渣中花色苷的影響。由圖4可知，隨提取時間的增加，花色苷的提取率相應增加。在30 min時，花色苷提取率達到最大值，而隨著提取時間的繼續增加，花色苷提取率變化不明顯。

圖4 提取時間對花色苷提取的影響Fig.4 Efect of the time on the total anthycanin content

2.3.4 超聲功率對花色苷提取的影響

考察在液料比為10∶1，超聲溫度為50℃的條件下，提取時間為30 min的條件下，超聲功率對60%乙醇提取黑莓果渣中花色苷的影響。由圖5可知，隨著超聲功率的增加，花色苷的提取率相應增加。在達到300 W時，花色苷提取量達到最大值，隨后逐漸減小。這可能是由于超聲功率太大時，超聲波強烈的機械振動使花色苷結構發生改變，從而對花色苷提取產生影響。因此超聲提取黑莓果渣中花色苷其功率以300 W左右為宜。

圖5 超聲功率對花色苷提取的影響Fig.5 Effect of the ultrasonic power on the total anthycanin content

圖6 提取次數對花色苷提取的影響Fig.6 Efect of the the number of extraction on the total anthycanin content

2.3.5 提取次數對花色苷提取的影響

在液料比為10∶1，超聲溫度為50℃的條件下，提取時間為30 min，功率為140 W條件下，考察提取黑莓果渣中花色苷的最佳次數。由圖6可知，當提取2次時，花色苷提取率即已基本達到最大值，故提取次數以2次為宜。

2.4 響應面優化實驗

2.4.1 結果及分析

利用軟件DesignExpert 6.0中的Box-ehnken中心組合設計，對提取時間、提取溫度和超聲功率設計響應面實驗，其結果見表3。

應用MiniTab計算機軟件對表3所得數據進行多元回歸擬合分析，擬合后得到得到關于時間(A)、溫度(B)、超聲功率(C)的二次多項式回歸模型為:

對此回歸模型進行方差分析(見表4)，結果表明，該模型極顯著(P＜0.01)，回歸模型調整確定系數R2=0.9591，矯正決定系數R2Adj=0.9066，說明回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可用此方程來分析和預測超聲提取花色苷的工藝結果。

從表4的分析結果可知，超聲提取溫度影響極顯著，而超聲提取時間和提取功率影響不顯著。在所選取的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序，超聲提取溫度＞提取時間＞超聲功率。通過Design Expert數據處理軟件得出花色苷含量最大值時各個因素組合，確定60%乙醇超聲輔助提取黑莓果渣中花色苷的最佳參數為:時間40 min，溫度57.45℃，功率300.87 W，此條件下提取花色苷含量為1395.99 mg/100 g。考慮到實際操作的便利，將最佳的黑莓果渣花色苷提取工藝修正為:時間40 min，溫度58℃，功率300 W。

表4 花色苷提取參數數學回歸分析結果Table 4 Variance analysis of items of regression equation

根據回歸分析結果，可得到相應的曲面圖，如圖 7～圖9示。

圖7 提出時間和溫度對提取花色苷量的影響Fig.7 Interaction of temperature and time on the total anthycanin content

由圖7可知:隨著提取溫度的增加，花色苷提取含量相應增加，但溫度超過一定值時，花色苷含量反而略有下降。隨提取時間的增加，花色苷含量略有增加，但其對花色苷含量的影響相對不太明顯。從其等高線圖可以看出此兩因素的交互作用顯著。

由圖8可以看出，當超聲功率較低時，花色苷含量隨超聲功率的增加而增加，但當超聲功率超過一定值時，花色苷含量又隨之降低。提取時間對花色苷含量影響相對不明顯。從其等高線圖可以看出此兩因素的交互作用不顯著。

由圖9可以看出，隨著溫度的增加，花色苷含量隨之增加，但當溫度達到一定值后，花色苷含量略有下降;功率對花色苷含量的影響相對不太明顯。從其等高線圖可以看出此兩因素的交互作用不顯著。

2.4.2 優化工藝的驗證

采用修正后的響應面提取條件進行三次平行實驗，結果花色苷含量平均值為1379.33 mg/100g，比響應面最佳條件下花色苷含量降低了1.2%，但差異不大，故本實驗選擇修正后的響應面最佳條件作為優化結果。

2.5 花色苷含量與清除自由基活性相關性分析

對不同條件下提取的溶液對應黑莓果渣花色苷含量與清除DPPH·活性進行相關性分析，結果表明:黑莓果渣提取物花色苷含量與清除DPPH·呈正的直線相關(相關系數為0.992，P=0.001＜0.05)。由此可以初步推斷黑莓果渣中花色苷為其主要抗氧化活性物質(見表5)。

表5 不同條件提取黑莓果渣花色苷含量與對應提取溶液清除自由基活性Table 5 The content of anthocyanins and free radical scavenging activity of different sample solution

3 結論

通過提取方法優選，表明超聲法對黑莓果渣中花色苷的提取效果最佳。以60%乙醇為超聲法提取溶劑，通過單因素實驗和響應面回歸分析法篩選提取黑莓果渣中花色苷最佳工藝條件為:時間40 min、溫度58℃、功率300 W、液料比14∶1(mL∶g)、提取2次。

黑莓果渣提取物對應花色苷含量與清除DPPH·活性之間呈正的直線相關，由此可以初步推斷黑莓果渣中花色苷為其主要清除自由基活性物質。

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Extraction Method of Anthocyanin in Blackberry Pomaces

LI Li1，2，LIU Ye-wei1*，YUE Xiong3，LI Li1，2，PENG Qian1，DI Duo-long2*1Institute of Nutrition and Food Hygiene，of Public Health，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China;2Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province，Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China;3Institute of Epidemiology and Health Statistics，of Public Health，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

The anthocyanin in the blackberry pomaces was extracted with the different metheods，and the results showed that the anthocyanin content of rasound-assisted extraction was the highest.The 60%ethanol was used to extract anthocyanin with ultrasonic assisted extraction and ratio of liquid to materia，ultrasoni time，extraction temperature，ultrasonic power，and extraction times were assessed in single-factors experiment.On the basis of single-factor test，the optimum conditions for the ultrasound assisted extraction of anthocyanin from blackberry pomaces were determined as follows using response surface method(RSM):the liquid-olid atio(mL∶g)14∶1，extraction time 40 min，extraction temperature 58℃，ultrasonic wave power 300 W，and two step extraction.The correlation analysis results showed that the anthocyanin content and DPPH·scavenging activity had significant correlation，and inferenced that anthocyanin was the main free radical scavenging substances.

blackberry pomaces;anthocyanin;extraction;response surface methodology;radical

1001-6880(2011)05-0939-07

2010-05-28 接受日期:2010-07-29

甘肅省自然科學基金(096RJZA058);中國科學院“百人計劃”擇優項目(O651301051)

*通訊作者 Tel:86-013519446679;E-mail:liuyw@lzu.edu.cn

R284.2;TS201.1

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