紫葉李樹葉中山奈酚的提取工藝研究

吳 波，張維農，嚴建芳，張寒俊

1武漢工業學院分析測試中心;2武漢工業學院食品科學與工程學院;3武漢工業學院化學與環境工程學院，武漢430023

紫葉李樹葉中山奈酚的提取工藝研究

吳 波1*，張維農2，嚴建芳3，張寒俊1

1武漢工業學院分析測試中心;2武漢工業學院食品科學與工程學院;3武漢工業學院化學與環境工程學院，武漢430023

該文測定了紫葉李樹葉中各黃酮苷元的含量，并對其中山奈酚的提取工藝進行了研究，重點探討了采用乙醇法提取紫葉李樹葉中山奈酚的最佳工藝條件，試驗結果表明:紫葉李樹葉中各黃酮苷元主要是槲皮素和山奈酚，乙醇提取紫葉李樹葉中山奈酚的最佳工藝參數為浸提劑乙醇濃度為70%﹑浸提溫度為50℃、料液比為1∶15、浸取時間為1.5 h。紫葉李樹葉中山奈酚的浸取率為92.7%，經浸取、濃縮、水解、萃取、結晶工藝后，其紫葉李樹葉中山奈酚的總得率為56.6%，山奈酚的純度為90.6%。

紫葉李樹葉;山奈酚;提取工藝

山奈酚(又名黃芪苷元，山奈黃素，Kaempferol)的結構為5，7，4'-三羥基黃酮醇，近年來，對其抗腫瘤、抗炎、抗氧化及抗菌等作用研究的比較多，它可逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性，保護神經細胞等研究中表現出顯著的活性［1-5］。薔薇科(Rosaceae)植物紫葉李(Prunus cerasifera)又叫紅葉李，是多年生落葉小喬木。原種產于亞洲西南部，較耐濕，有一定耐寒力，以葉色聞名，在整個生長期滿樹紅葉，尤其春秋兩季葉色更艷，現在我國廣泛種植，資源豐富［6］。其樹葉，經檢測，紫葉李樹葉中含較豐富的黃酮類物質，其中以山奈酚較為突出［7］。傳統的山奈酚制備一般采用醇提法、超聲波法、逆流色譜法等從姜科植物山奈(kaempferia galangal L.)的根莖、百蕊草(Thesium chinense Turcz.)的全草、槐樹(Sophora japonica L.)的果實、高良姜(Alpinia officinarum Hance)的根莖提取，山奈酚也是銀杏與沙棘等植物有效部位中主要的黃酮苷元之一［8，9］。筆者首次以紫葉李樹葉為原料，采用醇提法提取山奈酚，對提取工藝、相關影響因素等進行了一番探討，為其今后合理的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

電熱恒溫水浴鍋:上海博訊實業有限公司醫藥設備廠;HS80A恒溫振床:中科院武漢科學儀器廠; RE52CS旋轉蒸發器:上海亞榮生化儀器廠;SHZ-III型循環水真空泵:上海亞榮生化儀器廠;GZX-9140ME數顯鼓風干燥箱:上海迅達實業有限公司醫療設備廠;JB90-D型強力電動攪拌機:上海標本模型廠;VARIAN ProStar 210泵;7725I型手動進樣器;VARIAN363熒光檢測器;Waters柱后衍生系統。

槲皮素(Quercetin)(含量≥98%國藥集團化學試劑有限公司)，桑色素(Morin hydtate)(含量≥98%購于Fluka)，山奈酚(Kaempferol)(含量≥98%上海友思);無水乙醇(分析純);水(自制雙重蒸餾水);其它試劑為分析純。紫葉李樹葉采于武漢工業學院，3月和4月采葉，在60℃烘干、粉碎，10℃下儲存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫葉李樹葉及提取步驟中黃酮苷元的測定

1.2.1.1 紫葉李樹葉中黃酮苷元的測定:稱取粉碎的樹葉約5 g于250 mL碘量瓶，準確加入70%乙醇100 mL，50℃振蕩浸取兩個小時后，補足70%乙醇，搖勻。取5.00 mL浸取液，加入1 mL濃HCl(含0.2 g苯酚/mL)通N2、封口，在80℃下水解兩小時后，用無水乙醇用定容于10 mL，然后離心(10000 r/ min，40 s)，待測。

1.2.1.2 提取步驟中黃酮苷元的測定:準確移取各工序中的浸取液5.00 mL，按1.2.1.1加1 mL濃HCl、封口、水解、定容、離心、待測。以上樣液中黃酮苷元的HPLC測定方法及條件見文獻［7］。紫葉李樹葉中黃酮苷元的含量按下列公式計算:

式中:Y為黃酮苷元按線性回歸方程計算的進樣液的濃度(g/ml);w紫葉李樹葉的稱樣量(g)提取率(%)=提取黃酮苷元的絕對量/(原料中相應黃酮苷元的含量×稱樣量)×100%

1.2.2 紫葉李樹葉提取山奈酚最佳工藝正交優化試驗設計

表1 L9(34)正交試驗因素水平設計表Table 1 Design of L9(34)orthogonal test

1.2.3 試樣溶液的制備

稱取100 g的粉碎的紫葉李樹葉，按15∶1的液料比加70%乙醇，在50℃水浴下攪拌1.5 h，過濾，濾餅用適量的70%乙醇沖洗，合并濾液，將其減壓濃縮后，加濃HCl，調節HCl濃度為2 mol/L，添加還原劑(0.5%w/v)，抽真空、通N2、封口，在80℃下水解2 h，冷卻后用200 mL乙醚萃取(三次)，將乙醚萃取液減壓濃縮后用無水乙醇溶解，過濾，結晶得山奈酚產品，按原色譜條件測其相應峰的面積，由標準曲線計算其含量，其譜圖見圖1。

圖1 樣品的高效液相色譜圖(1.槲皮素;2.山奈粉)Fig.1 HPLC chromatogram of sample(1.Quercetin;2. Kaempferol)

2 結果與分析

2.1 紫葉李樹葉中各黃酮苷元的測定結果

按照“1.2.1.1”的方法測定紫葉李樹葉中槲皮素和山奈酚的平均含量分別為1.02%和3.21%，山奈酚占其總黃酮苷元為75.8%。本結果以紫葉李樹葉中山奈酚實際的“真實”含量，作為以下計算提取效果的依據。

2.2 提取劑及提取方式的選擇

分別用堿性水溶液(pH=9.00)、70%乙醇、70%甲醇、70%丙酮溶液按“1.2.1.1”的方法分別提取、測定，其山奈酚的提取率分別為65.2%、92. 1%、91.4%和90.8%，從試驗結果可以看出，堿性水溶液提取率較低，故棄之，乙醇、甲醇、丙酮其提取率差不多，從生產安全因素考慮，采用70%乙醇較適宜，所以以下研究均以乙醇為溶劑。

在提取方式上，目前采用超聲波、微波的比較多，而超聲波其作用面和深度是有限的，而微波其反應罐體積不大，這兩種方式并不適合于大規模生產制備，在本試驗中選擇攪拌結合控溫的方式進行。

2.3 乙醇濃度對浸取效果的影響

分別用不同的乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%和90%)，按上述試驗操作步驟，在50℃下，攪拌回流提取時間為2 h，液料比為15∶1，提取，按“1.2.1.2”步驟進行測定，試驗結果見圖2。從圖2可以看出，當乙醇濃度大于70%以后，其提取率大幅下降，這可能與其所連結的糖苷鍵有關。考慮到后面的過濾工序及提取劑極性增大會給后序的純化帶來不利，因此乙醇濃度≤70%為好。

圖2 乙醇濃度對紫葉李樹葉中山奈酚浸提效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of kaempferol from P.cerasifera leaves

2.4 溫度對浸提效果的影響

分別用不同的溫度(30、40、50、60、70℃和80℃)，按上述試驗操作步驟，以70%乙醇為提取劑，攪拌回流提取時間為2 h，液料比為15∶1，提取，按1.2.1.2步驟進行測定，試驗結果見圖3，圖中可以看出，提取溫度在50℃為宜，溫度太高可能導致山奈酚的氧化。

圖3 溫度對紫葉李樹葉中山奈酚浸提效果的影響Fig.3 Effect of extracting temperature on the extraction efficiency of kaempferol from P.cerasifera leaves

2.5 液料比對浸提效果的影響

分別用不同的液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1)，按上述試驗操作步驟，以70%乙醇為提取劑，在50℃下，攪拌回流提取時間為2 h，提取，按1.2.1.2步驟進行測定，測定結果見圖4。從圖中可以看出液料比為15∶1時，浸提已達到較好的效果，再增加溶劑的量對提取率影響不大，故以液料比為15∶1時較好。

圖4 液料比對紫葉李樹葉中山奈酚浸提效果的影響Fig.4 Effect of the ratio of material weight to solvent volume(w/v)on the extraction efficiency of kaempferol from P.cerasifera leaves

2.6 浸提時間對浸提效果的影響

分別用不同的浸提時間(1、1.5、2、2.5、3、3.5 h)，按上述試驗操作步驟，以70%乙醇濃度為提取劑，在50℃下，液料比為15∶1時，提取，按1.2.1.2步驟進行測定，測定結果見圖5.從圖中可以看出浸取時間在1.5 h就可以達到比較好的效果。

圖5 浸提時間對紫葉李樹葉中山奈酚浸提效果的影響Fig.5 Effect of extracting time on the extraction efficiency of kaempferol from P.cerasifera leaves

2.7 正交試驗確定提取的最佳條件

在單因素試驗的基礎上，選取對山奈酚得率影響較大的4個因素(每個因素取三個水平):溶劑乙醇濃度(%)、液料比、溫度(℃)、浸提時間(h)進行正交試驗考察，見表1。正交試驗方案及結果見表2。從表2試驗結果可以看出:極差分析為C＞A＞D＞B，提取紫葉李樹葉中山奈酚的最佳條件為A2B2C1D1，即乙醇濃度為70% ，料液比為1∶15，溫度為50℃ ，浸提時間為1.5 h。經驗證性試驗結果表明:山奈酚提取率可達92.7%。

表2 Lg(3)正交試驗設計方案及結果Table 2 Design and results of orthogonal experiment(n=3)

2.8 浸出物的水解

紫葉李樹葉的浸出物，其黃酮主要以其苷的形態存在［7］，需經水解變成苷元，目前，水解方式一般有酶解和酸水解兩種。β-糖苷酶水解時，其反應條件溫和，對黃酮的形態影響不大，但反應中轉化率不高，易形成多種產物。酸水解，主要以2 mol/L的氫質子的鹽酸、硫酸在一定溫度下進行［10，11］，反應中要注意對黃酮的保護，黃酮在反應中可完全轉化成苷元。本試驗采用2 mol/L的鹽酸，在80℃下水解，通過添加還原劑(0.5%w/v)、抽真空、通N2、封口來保護黃酮，經檢測，山奈酚在水解過程中其提取率可達90%以上。

2.9 在最佳條件下提取紫葉李樹葉中山奈酚的重現性

按步驟“1.2.3”進行樣品的制備，結果見表3，從表中可以看出最終產品中山奈酚的平均含量為90.6%，其平均得率為56.6%。

表3 從紫葉李樹葉中提取山奈酚試驗結果Table 3 Results of kaempferol experiment from Prunus cerasifera leaves(n=3)

3 結論

本文對紫葉李樹葉中各黃酮苷元含量進行了測定，重點探討了采用乙醇提取法提取紫葉李樹葉中山奈酚化合物的最佳工藝條件。試驗結果表明:紫葉李樹葉中槲皮素、山奈酚的含量分別為1.02%、3.21%;乙醇提取法的最適工藝參數是浸提劑乙醇濃度為70%、浸提溫度為50℃、液料比15∶1、浸提時間為1.5 h，山奈酚提取率可達92.7%，經浸取、濃縮、水解、萃取、結晶工藝后，其紫葉李樹葉中山奈酚的總得率為56.6%，山奈酚的純度為90.6%，本項研究為紫葉李樹葉中黃酮的開發利用提供了科學依據。

1Mu JJ(慕靜靜)，Zeng YY(曾耀英)，Huang XY(黃秀艷)， et al.Efects of kaempferol on activation，proliferation and cell cycle of mouse T lym phocytes in vitro.Chin J Cell Mol Immunol(細胞與分子免疫學雜志)，2009，25:1106-1108.

2Lin XC(林小聰)，Liu XG(劉新光)，Chen XW(陳小文)，et al.Inhibitory effect of kaempferol on protein kinase CK2 in vitro and in HL260 cells.Chin J Biochem Mol Biol(中國生物化學與分子生物學報)，2006.22:894-901.

3 Seitz C，Eder C，Deiml B，et al.Cloning，functional identification and sequence analysis of flavonoid 3￠-hydroxylase and flavonoid 3￠，5￠-hydroxylase cDNAs reveals independent evolution of flavonoid 3￠，5￠-hydroxylase in the Asteraceae family Christian.Plant Mol Biol，2006，61:365-381.

4 Ghosh A，Kanti Das B，Roy A，et al.Antibacterial activity of some medicinal plant extracts.J Nat Med，2008，62:259-262.

5 Kemertelidze E，Shalashvili K，Korsantiya B，et al.Therapeutic effect of phenolic compounds isolated from Rhododendron ungernii leaves.Pharm Chem J，2007，41:10-13.

6 Jiang WB(姜衛兵)，Zhuang M(莊猛)，Shen ZJ(沈志軍)，et al.Study on the photosynthetic characteristics of red-leaf peach and purple-leaf plum in different sea sons.Acta Horticul Sin(園藝學報)，2006，33:577-582.

7 Wu B(吳波)，Du SL(杜勝藍)，Lin WJ(劉文杰).Determination of flavonoids in tree leaves by HPLC with fluorescence detector.Anal Instrum(分析儀器)，2009，4:41-43.

8 Yang XW(楊秀偉).Traditional Chinese Medicine Composition Supersession Analysis(中藥成分代謝分析).Beijing: Scientific and Technological Publishing House of Chinese Medicin，2003.566-568.

9 Gutzeit1 D，Wray V，Winterhalter P.et al.Preparative isolation and purification of flavonoids and protocatechuic acid from sea buckthorn juice concentrate(Hippophae rhamnoides L.ssp.rhamnoides)by high-speed counter-current chromatography.Chrogatographia，2007，65:1-7.

10 Lai YH(賴宇紅)，Tong HZ(童惠貞)，Xian YF(冼彥芳)，et al.Flavonoids hydrolysis conditions in EGb quantification. J China Pharm Univ(中國醫科大學學報)，2007，38:569-571.

11 Wu Y(伍毅)，Wang HX(王洪新).Study on hydrolyzing ginkgo flavone glycoside with β-glycosidase.J Anhui Agric Sci(安徽農業科學)，2008，36:30-32.

Optimum Extraction Technology of Kaempferol in Prunus cerasifera Leaves

WU Bo1*，ZHANG Wei-nong2，YAN Jian-fang3，ZHANG Han-jun11Center of Analysis and Measurement，Wuhan Polytechnic University;2Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University;3Chemical and Environmental Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China

The content of flavonoids in Prunus cerasifera leaves and its extraction technology were studied in this paper. By means of ethanol extracting，the optimum extraction conditions of kaempferol in P.cerasifera leaves were determined. The results showed that the content of quercetin and kaempferol were major flavonoids in P.cerasifera leaves，the optimum conditions of ethanol extracting were obtained as follows:70%ethanol as extraction solvent at 50℃for 1.5 h，and the ratio of material to solvent was 1∶15.Using the technological parameters above mentioned，the average extraction rate of kaempferol was 92.7%.After extracting，concentration，hydrolyzing，extraction and crystal，the average recoveries and product purity of kaempferol were 56.6%and 90.6%，respectively.

Prunus cerasifera leaves;kaempferol;extraction technology

1001-6880(2011)05-0952-04

2010-08-13 接受日期:2010-10-28

湖北省教育廳重點科研資助項目(D20101712)

*通訊作者 Tel:86-013006153299;E-mail:wb@whpu.edu.cn

Q946.91;R284.2

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