SNIF-NMR和IRMS技術在原產地葡萄酒鑒定中的應用*

薛潔，蔣露

1(中國食品發酵工業研究院，北京，100027)

2(昆明市農產品質量安全中心，云南昆明，650018)

SNIF-NMR和IRMS技術在原產地葡萄酒鑒定中的應用*

薛潔1，蔣露2

1(中國食品發酵工業研究院，北京，100027)

2(昆明市農產品質量安全中心，云南昆明，650018)

利用點特異性天然同位素分餾核磁共振技術(SNIF-NMR)和同位素比質譜儀(IRMS)技術測定葡萄酒中穩定性同位素D/H、18O/16O和13C/12C的比值，結果表明(D/H)Ⅱ、R、δ18O‰對產地的鑒別提供著主要信息，而(D/H)Ⅰ與δ13C‰提供了較次要的信息，單獨使用SNIF-NMR結果只能區別開環境差異很大的地區，加上δ13C‰后，可將溫差大的地區區別開，但對環境相似的地區仍無法有效鑒別，最后將(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰、δ18O‰同時考慮，對于環境相似的地區也可以有效鑒別。研究結果為中國葡萄酒原產地鑒別提供了一種新的技術手段。

SNIF-NMR，IRMS，葡萄酒，穩定同位素分析，原產地

葡萄酒的香氣和口感與葡萄種植地有很大關系，原產地在葡萄酒質量評價中起著非常重要的作用。1930年法國首先建立了原產地分級制度，即‘Appellation d’Origine Controlee’(AOC)，不久這種分級方法成為世界葡萄酒生產國的分級模式，如意大利的DOC制度、西班牙的DO制度、德國的QmP制度等，所有這些分級方法都是用于定義和保護特殊地理區域的葡萄酒，因此不同地理來源的葡萄酒進行分類和鑒定成為葡萄酒行業的最近幾年研究熱點之一。

穩定同位素分析技術是一種十分有效的分析工具，尤其在食品和飲料保真鑒定領域尤為重要［1］。1994年，意大利學者Ambrogio Monetti等利用SNIFNMR研究意大利不同地區、不同年份的葡萄酒，發現部分地區的數值出現重疊，單一使用該方法無法有效鑒別意大利的葡萄酒原產地，需要其他同位素參數的參與［2］，隨后許多研究將SNIF-NMR和IRMS技術結合起來用于葡萄酒的原產地鑒定中。2001年，Orginc等利用SNIF-NMR和IRMS技術分析葡萄酒中的δ13C‰ ，δ18O‰ 和2H/1H，對3個不同產區的葡萄酒進行了有效鑒別［3］;2001年西班牙學者 Josep等利用2H-SNIF-NMR和13C-IRMS技術對巴倫西亞地區紅葡萄酒原產地進行了鑒別，分離效果也非常明顯［4］。但是由于同位素受氣候、土壤和水質等多種因素的影響，它能否適應于我國主要產區葡萄酒的鑒定還必須進行深入的研究探討。本研究分析了我國4個主要葡萄產區葡萄酒中碳、氫、氧同位素的組成，探討了同位素分析技術在葡萄酒產地溯源的可行性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1．1．1 葡萄酒樣品

霞多麗葡萄品種，來自于2008年中國河北懷來、河北沙城、山東蓬萊和寧夏4個產區，實驗室自制葡萄酒樣品，2007年4個產區的氣候條件如表1所示。

表1 07年懷來、沙城、煙臺、寧夏的氣象情況

1．1．2 儀器與設備

Bruker 400型核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司;MAT-253型同位素比質譜儀(測量精度優于萬分之2)，美國Thermo Fosjer Scienlific公司;酒精分餾裝置，實驗室自制。

1．1．3 主要化學試劑

四甲基脲(TMU):比利時歐洲標準物質測量研究院。平均標準海洋水(V-SMOW):國際原子能機構(IAEA)提供。

1.2 試驗方法

1．2．1 樣品制備

釀造工藝:參考文獻［5］，所有處理均重復3次。

1．2．2 葡萄酒中酒精和水的提取

1．2．2．1 酒精的提取

參照EU官方方法，將葡萄酒樣品裝入250 mL圓底燒瓶中，圓底燒瓶置于不斷回流的蒸餾儀器上，在78．0～78．2℃收集沸騰的液體，如果蒸餾過程中溫度超過78．5℃，中斷收集5 min，當溫度降到78℃時再重新收集蒸餾液體直到溫度再次升到78．5℃，重復這些操作直到溫度保持恒定。收集的酒精樣品純度在92% ～93%(m/v)，回收率在95%以上。

1．2．2．2 水分的提取

將蒸餾后的葡萄酒殘渣，在100℃下繼續蒸餾，收集葡萄酒中的水分，對水分中的同位素進行檢測。

2 樣品分析

2.1SNIF-NMR檢測

2．1．1 原理

由于植物代謝類型的不同，在葡萄汁發酵前添加外源糖，生成的乙醇會發生氘的同位素分餾現象，氘同位素會在以下 4個位置重新分布［4］:甲基位(CH2DCH2OH)、次 甲 基 (CH3CHDOH)、羥 基 位(CH3CH2OD)和水分子(HOD)，這種分布特點被稱為點特異性同位素分布，SNIF-NMR技術可以檢測出乙醇分子特定位置上氘的相對濃度［7］，如圖1所示。

圖1 葡萄酒乙醇分子2H-NMR分析圖譜

圖1中不同峰代表乙醇分子中不同位點D/H的比值，分析時通過添加一個已知D/H含量的內標物質，從而計算出葡萄酒乙醇分子各位點的D/H含量［8］。

2．1．2 NMR 檢測樣品的準備［2］

準確稱取 1．2．2．1 中制得的乙醇溶液 3．2 mg(精確至 0．1 mg)，加入 1．3 mgTMU(精確至 0．1 mg)，混勻，取450 μL 供 NMR 分析。

2．1．3 NMR檢測條件及計算公式

磁場強度:400 MHZ;共振頻率:61．2 MHZ;掃描寬度:1 200 Hz;檢測時間:6．8s;累計采樣次數2 043次［7］。

D/H 比值按下面的公式進行計算［2，6，9］:

其中t為樣品的乙醇體積分數。

2.2 IRMS檢測

2．2．1 IRMS檢測葡萄酒水分子18O/16O的原理

由于蒸騰作用，植株中同位素富集，使植物自身水分子中18O/16O的含量相對自來水、地表水較高［8］，如果在釀造期間外加水，其18O/16O的比值會降低，因此通過測定葡萄酒中水分子18O/16O的比值，可鑒別葡萄酒在生產過程中是否進行了加水行為，目前測定18O/16O的比值主要利用IRMS技術。同位素比質譜儀通過測CO2中離子質量m/z 46(12C16O18O)和m/z 44(12C16O16O)比值的變化來判斷水中18O/16O同位素的含量［9］，主要反應如下:

C16O16O(氣)+H218O(液)=C16O18O(氣)+H2160(液)

結果計算:

樣品中18O/16O的相對含量可用δ‰來表示［9］:

其中SMOW為國際標準參考值。

2．2．2 IRMS檢測葡萄酒乙醇分子13C/12C的原理

乙醇溶液在850℃高溫煅燒下，被氧化成CO2和H2O，然后在真空系統中除掉一切雜質提取出純凈的CO2，供質譜測量其碳同位素比值。

結果計算:

樣品中13C/12C的相對含量可用δ‰來表示:

其中PDB為國際標準參考值。

3 結果與分析

3.1 不同產區霞多麗葡萄酒中同位素分析結果

按照葡萄酒釀造工藝，利用不同地區的葡萄汁，生產出全汁干白葡萄酒，提取葡萄酒中的乙醇和水分別進行SNIF-NMR和IRMS檢測，分別結果如表2所示。

LSD在0．05水平下分析發現，4個城市的(D/H)Ⅰ值差異均不明顯，(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰值寧夏、煙臺與河北省的兩個產區差異明顯，而4個產區的δ18O‰差異均顯著。

表2 各產區葡萄酒的C、H、O同位素分析結果

對各組數值進行主成分分析發現，(D/H)Ⅱ、R、δ18O‰對產地的鑒別提供著主要信息，而δ13C‰與(D/H)Ⅰ提供了較次要的信息。詳細結果見總方差分解表(表3)和初始因子載荷表(表4)。這進一步說明了(D/H)Ⅰ與δ13C‰與植物的種類有關，(D/H)Ⅱ與發酵環境有關，不同地區的葡萄酒(D/H)Ⅰ變化較小，在 97．386 9 ～98．573 9 mg/L，δ13C‰變化稍大，因其除了與植物光合作用途經相關外，還與溫度有一定關系，在 -26．579‰ ～ -28．352‰之間變動，而(D/H)Ⅱ與發酵環境有關，δ18O‰與降水量有關，所以不同地區的葡萄酒(D/H)Ⅱ、和δ18O‰值差異較大。

表3 總方差分解表

提取方法:主成分分析。

表4 旋轉前因子載荷表

提取方法:主成分分析。a．提取成分

利用主成分分析分別對單獨使用(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R 即 SNIF-NMR方法的結果，以及(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R 和 δ13C‰聯用，(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰和δ18O‰3個同位素同時測定，這3種情況進行研究，得出如下結果:

從圖1可以看出，單獨利用SNIF-NMR檢測結果對4個產地的鑒別效果不明顯，尤其是對煙臺、懷來和沙城3個產區的鑒別力度很弱，這主要是因為地區間(D/H)Ⅰ值變化很小，所以就(D/H)Ⅱ和R作為第1主成分只能鑒別出環境差異很大的地區，如內陸氣候的寧夏產區。當加入δ13C‰指標后(圖2)，煙臺也得到了很好的區分，環境非常相似的沙城和懷來還是部分重疊，δ13C‰主要受植株的光合作用途徑和溫度的影響，所以在(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R的基礎上加上δ13C‰，就將日照強度明顯不同、離海洋更近的煙臺與懷來和沙城區別開來。同時利用(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰和δ18O‰對進行原產地的鑒別，結果發現區分度又進一步提高，基本只有懷來和沙城的1～2個樣品未被分開，δ18O‰值與降雨量有關，說明δ18O‰對地理環境相似、天氣情況也雷同，但降雨量不同的地區區分度較大。試驗對不同地區的紅葡萄酒樣品也進行了鑒別分析，發現結果與白葡萄酒基本一致，其(D/H)Ⅰ在 97．0257 ～ 98．378 3 mg/L δ13C‰值在 -25．626% ～ -28．228‰。因此，由實驗可知，聯合SNIF-NMR和IRMS技術檢測葡萄酒里的C、H、O同位素，能有效鑒別環境差異大的地區的葡萄酒產品，對環境相似的地區在一定程度上也能將其區別開來，是一種比較可行的鑒別葡萄酒原產地的方法。

3.2 同一地區不同品種葡萄酒中同位素分析結果

世界上適合釀造葡萄酒的葡萄品種有幾千種。在同樣的栽培條件下，不同的品種，具有不同的色香味，含有不同量的糖、酸、芳香物質、酚類物質及其他物質。這些成分，決定了所釀成的葡萄酒的酒度、酸度、芳香性、優雅性。有的香氣特別濃，有的顏色特別深。因此，許多葡萄酒生產廠商將不同的葡萄品種巧妙地搭配使用，釀造混合型的葡萄酒，從而取長補短，相得益彰。那么，不同品種葡萄釀造出的葡萄酒其C、H、O穩定同位素的含量差異是否明顯，也是此次的研究內容，本實驗對同一產區同一時間收獲的干紅葡萄酒釀造品種赤霞珠和梅鹿輒采用相同工藝釀造的葡萄酒進行C、H、O同位素檢測，結果見表5。

圖1 SNIF-NMR鑒別原產地的結果

圖2 (D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R和 δ13C‰對原產地的鑒別結果

圖3 (D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰和 δ18O‰對原產地的鑒別結果

表5 葡萄品種對同位素的影響

結果研究表明:同一產區同一時間收獲的不同葡萄品種，采用相同工藝釀造出的葡萄酒其δ18O‰、δ13C‰、(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R 值均非常接近，不存在顯著性差異，說明品種對葡萄酒的同位素含量影響不大。進一步說明(D/H)Ⅱ和δ18O‰與葡萄植株的產區降水量等環境條件相關，赤霞珠和梅鹿輒在同一產區栽培、同一時間收獲，其土壤條件、氣候條件都一致，所以(D/H)Ⅱ和 δ18O‰變化很小;而(D/H)Ⅰ和δ13C‰的含量主要取決于發酵原料的生物起源，即植株的種類。赤霞珠和梅鹿輒葡萄均屬C3植物，光合作用途徑相同，同屬葡萄品種，實驗結果證明其(D/H)Ⅰ和δ13C‰值在同一范圍內。

4 結論

本研究利用SNIF-NMR和IRMS技術對國內河北懷來、河北沙城、寧夏、煙臺4個產區的葡萄酒進行C、H、O 同位素測定，研究發現(D/H)Ⅱ、R、δ18O‰對產地的鑒別提供著主要信息，而(D/H)Ⅰ與δ13C‰提供了較次要的信息，單獨使用SNIF-NMR技術的結果只能區別開環境差異很大的地區，加上δ13C‰后，進一步將溫差大的地區區別開，但對環境相似的地區仍無法有效鑒別，最后將(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰、δ18O‰同時利用，可將環境相似的2個地區有效區分開。

通過分析同一產區的不同品種葡萄酒發現，葡萄品種對同位素含量的影響不明顯，因此推斷利用(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰、δ18O‰同位素判別葡萄酒產區不受葡萄品種的影響。

天然同位素分析技術是一種國際通用的酒類產品分析方法，在葡萄酒及蒸餾酒中普遍應用，歐盟各國家通過分析葡萄酒的同位素信息，在意大利Ispra的歐盟聯合研究中心(JRC)中建立了“葡萄酒數據銀行”，記錄了不同年份、不同地區、不同品種的葡萄酒同位素信息，通過分析酒樣中各同位素的含量，然后與數據銀行中的數據進行比對，從而為葡萄酒產地、年份、品種的判別提供依據。利用穩定同位素分析，從原子水平對產區酒進行分析在國內還沒見相關報道，本試驗的應用為我國葡萄酒質量評價提供了全新的技術支持。

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The Preliminary Research on Wine Geographical Origins Determination by SNIF-NMR and IRMS Methods

Xue Jie1，Jiang Lu2
1(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100027，China)
2(Agricultural Product Quality Safety Center in Kunming，Kunming 650018，China)

SNIF-NMR and IRMS methods were used to determine the stable isotopic ratios of D/H and18O/16O of wine．The results showed that methylene(D/H)Ⅱof ethanol in wine，R andδ18O‰ are the key determinants in identifying the geographical origin of wines whereas methyl(D/H)Ⅰsite andδ13C‰ provide less significant information．Using the results of SNIF-NMR alone can only distinguish areas of considerably different environment．If coupled withδ13C‰，the areas with different temperature can be distinguished，but the areas with similar environment still cannot be separated．If combined the values of(D/H)Ⅰ，(D/H)Ⅱ，R，δ13C‰ andδ18O‰，SNIF-NMR and IRMS methods can differentiate areas with similar environment．The research outcome provides a new technique to determine the geographical origins of Chinese wine．

SNIF-NMR，IRMS，wine，stable isotopes analysis，geographical origin of wines

博士，高級工程師。

*中國輕工集團科技基金項目

2010-11-08，改回日期:2010-11-25