紅酵母細胞通透性研究

李永紅， 朱登勇， 王 姣， 侯立芬， 劉宏民

(1.鄭州大學 新藥研究開發中心 河南 鄭州 450001； 2.鄭州大學 藥學院 河南 鄭州 450001；3.鄭州大學 化學系 河南 鄭州 450001)

紅酵母細胞通透性研究

李永紅1,2， 朱登勇3， 王 姣3， 侯立芬3， 劉宏民1,2

(1.鄭州大學 新藥研究開發中心 河南 鄭州 450001； 2.鄭州大學 藥學院 河南 鄭州 450001；3.鄭州大學 化學系 河南 鄭州 450001)

用插入式超聲、反復凍融和有機溶劑法對細胞通透性進行處理.結果表明，在超聲功率為750 W，超聲時間3 s和間隔時間4 s的條件下，超聲處理75次效果最佳；加入甲苯、氯仿和正己烷等有機溶劑均可提高細胞通透性，其中甲苯的效果最好.

紅酵母； 細胞通透性； 超聲； 反復凍融； 有機溶劑

0 引言

在生物轉化過程中，如果所用的酶是胞內酶，細胞的通透性在很大程度上影響轉化率.改變細胞膜的通透性有利于代謝產物在細胞外(培養基中) 的累積，使代謝朝著人們希望的方向進行.

用固定化細胞進行生物轉化具有顯著的優越性.但固定化以后，細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限制作用，增大細胞膜通透性可以減小細胞膜、細胞壁的擴散限制作用，提高轉化速度.常用于改變細胞通透性的方法有超聲法、反復凍融法和有機溶劑法[1-8].

作者在實驗中篩選到一株能產生立體選擇性脂肪酶的紅酵母[9]，利用其建立了生物拆分法制備S-倍他洛爾的新工藝[10]，并對細胞固定化進行研究，為了提高固定化細胞的轉化速率，需要對細胞的通透性進行研究.

1 材料與方法

1.1儀器

超聲波細胞粉碎機JY92-Π型(寧波新芝科器研究所)，恒溫搖瓶柜HYG-Ⅱa型(上海欣蕊自動化設備有限公司)，薄層掃描色譜儀CS-930型(島津公司)，YJ超凈工作臺(蘇州市潔凈工作研究所)，pH計(上海精密科學儀器有限公司)，Syltech 500高效液相色譜儀(浙江大學智達信息工程有限公司)，Chiralcel OJ-H色譜柱(Dicel 公司).

1.2材料與試劑

菌種為本實驗室篩選并保藏的一株膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)DQ832198.

玉米漿由安陽第一制藥廠提供；氯仿、乙酸乙酯由工業品重蒸得到；瓊脂粉、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、丙酮及其他試劑均為分析純.

1.3細胞的培養與處理

1.3.1細胞培養 培養基配方為：蛋白胨為0.2%，玉米漿為2%，甘油為3%，pH 5.7.接種后于32 ℃，210 r/min培養40 h.

1.3.2超聲處理[7]將紅酵母細胞分裝入錐形瓶中，加入已滅菌的pH 6.0緩沖溶液，用不同超聲功率及不同超聲次數(超聲條件：超聲時間3 s，間隔時間4 s)進行處理(超聲處理在冰水浴中進行).以不作任何處理的細胞作為空白對照.

1.3.3反復凍融處理[4-5]將紅酵母細胞置于冰箱中-85 ℃凍存10 min，取出，30 ℃水浴融化，反復凍融三次，置于冰箱4 ℃保存.以不作任何處理的細胞作為空白對照.

1.4生物轉化

1.4.1水相中轉化 在處理好的細胞懸液中加入3 g/L的底物，于28 ℃，210 r/min進行轉化，間隔一定時間取樣.

1.4.2兩相體系中轉化 將緩沖液分裝到三角瓶中，滅菌后加入3 g/L底物及適量有機溶劑，將離心過的細胞平均分至各瓶，于28 ℃，210 r/min進行轉化.

1.5轉化產物分析

轉化產物用TLC[11]和HPLC[12]方法進行分析.改變細胞通透性是為了增大底物的轉化速率，所以用轉化率來判斷細胞通透性的好壞.轉化率高即表示細胞通透性好.

1.5.1轉化產物的提取 用等體積的乙酸乙酯萃取轉化液三次，將乙酸乙酯相用飽和NaHCO3溶液洗三次，飽和NaCl溶液洗三次，再用蒸餾水洗一次.飽和NaHCO3相和飽和NaCl相用乙酸乙酯反萃取一次.合并有機相，用無水Na2SO4干燥后用于HPLC法測定.

1.5.2轉化產物的測定 采用HPLC方法檢測轉化產物濃度，以手性Chiralcel OJ-H柱為固定相，正己烷-異丙醇(體積比85∶15)為流動相，檢測波長273 nm.并在此基礎上計算轉化率.由于化合物Ⅱ是目標產物(圖1)，所以以化合物Ⅱ的量占加入底物量的百分率來表示轉化率.

圖1 藥物中間體拆分原理示意圖Fig.1 Scheme of drug intermediate resolution

生物轉化和其他酶促反應一樣符合米氏曲線，所以，應該研究在米氏曲線上處于一級反應階段時的轉化率，因此在研究超聲影響時選擇轉化30 min時的轉化率.而研究有機溶劑影響時由于反應體系不同，也對不同體系的轉化曲線進行了研究.

2 結果與討論

圖2 不同條件超聲處理細胞的轉化曲線Fig.2 Conversion by cells treated by different ultrasonic conditions

2.1插入式超聲對細胞通透性的影響

不同條件超聲處理后的轉化結果如圖2所示.

由圖2可以看出，功率為400 W時，超聲60和75次時轉化率較高，與空白對照相當；功率為500 W時，超聲75次轉化率比空白對照高，90次時與空白對照相當；功率為600 W時，超聲次數從60次開始，轉化率都要比空白對照高；功率為750 W時，超聲60次以上轉化率都要比空白對照好，超聲75次已明顯高于空白對照.結論：隨著超聲次數的增加，轉化率呈先升后降的趨勢，超聲75次時轉化率最高；隨超聲功率的增加，轉化率呈不斷增加的趨勢(見表1).

表1 超聲次數為75次時各個功率下的轉化率

產生上述結果的可能原因是：①功率相同時，超聲處理次數不同使細胞受損產生的滲漏程度以及酶活性受到的影響不同.隨著超聲次數增多，酶蛋白活性受損，但細胞通透性提高，這兩種作用對轉化率產生相反的影響，處理75次轉化率最高是這兩種因素共同作用的結果.②酵母菌為真菌，細胞壁比較堅韌，必須在大功率條件下才能達到較好的滲漏效果，因此本研究中在750 W功率下效果最明顯，如果提高功率效果可能更好.

2.2有機溶劑對細胞通透性的影響

研究有機溶劑的影響需要以水相中的轉化結果為參照.水相中的轉化曲線如圖3所示.由圖3可知，反應體系中沒有加入有機溶劑時轉化速度很慢，最高速率為0.075/h，反應6 h達到最高轉化率45%.

2.2.1氯仿對轉化的影響 在氯仿-水雙相體系中轉化時的轉化曲線如圖4.由圖4可知，反應體系中加入氯仿后，最高轉化速率為0.078/h，反應3 h轉化率達到56%，以后隨時間變化不明顯.

圖3 水相中的轉化曲線Fig.3 Conversion in aqueous phase

圖4 在氯仿-水雙相體系中的轉化曲線Fig.4 Conversion in aqueous-chloroform double phase

2.2.2正己烷對轉化的影響 正己烷-水雙相體系中的轉化曲線如圖5.由圖5可以看出，反應體系中加入正己烷后，反應3 h轉化率基本達到最大值61%，最高速率為0.058/h.

2.2.3甲苯對轉化的影響 甲苯-水雙相體系中的轉化曲線如圖6.由圖6可知,反應體系中加入甲苯后，反應1 h產物轉化率就達到66%，最高速率為0.27/h.這是由于加入甲苯后細胞的通透性發生改變，酶與底物可以充分接觸，從而提高了底物的轉化速率.

由圖3～6可以看出：體系中不加有機溶劑，反應速度很慢，加入有機溶劑能夠使反應效率迅速提高，其中甲苯效果最好.表2為不同體系的轉化效果比較.

圖5 在正己烷-水雙相體系中的轉化曲線Fig.5 Conversion in aqueous-hexane double phase

圖6 在甲苯-水雙相體系中的轉化曲線Fig.6 Conversion in aqueous-toluene double phase

表2 各溶劑中底物的最高轉化速率

進一步對甲苯用量進行了研究，結果如圖7.由圖7可知，甲苯加入量小于15%時，轉化速率隨甲苯量的增加而提高；當加入量大于15%時，影響不明顯.

圖7 體系中甲苯含量對轉化的影響Fig.7 Effect of toluene content on conversion

2.3反復凍融對細胞通透性的影響

細胞反復凍融三次后，轉化結果和空白幾乎相同.

3 結論

經過對不同方法的研究得出以下結論：

1)超聲處理能提高細胞通透性.隨著超聲次數的增加，轉化率呈先升后降的趨勢，超聲75次時轉化率最高；功率小于750 W時效果隨功率的增加而提高.

2)反復凍融對細胞通透性的影響不明顯.

3)甲苯、氯仿、正己烷等有機溶劑均可提高細胞的通透性，其中甲苯的效果最好.

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StudyontheCellularPermeabilityofRhodotorula

LI Yong-hong1,2, ZHU Deng-yong3, WANG Jiao3, HOU Li-fen3, LIU Hong-min1,2

(1.NewDrugResearch&DevelopmentCenter,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China;2.SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China;3.DepartmentofChemistry,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

Probe ultrasound,repeated freeze thawing and organic solvents were used to increase cellular permeability. It was discovered that the best result was obtained with supersonic power 750 W,supersonic time 3 s,time interval 4 s,and the supersonic times 75. Toluene,chloroform and n-hexane could increase cellular permeability,with toluene the best.

rhodotorula;cellular permeability;ultrasonic;repeated freeze-thaw;organic solvent

Q 932

A

1671-6841(2011)04-0100-04

2010-12-08

李永紅(1970-)，女，副教授，博士，主要從事生物學研究，E-mail:lyh224@163.com；通訊作者：劉宏民(1960-)，男，教授，博士，主要從事藥物化學研究，E-mail:liuhm@zzu.edu.cn.