丁基苯酞對慢性腦缺血老齡大鼠腦組織TRPM2和核酸內(nèi)切酶G的影響

張會芳，盧 宏#，焦淑潔，劉 希

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州 450052 2)鄭州大學第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州 450052

#通訊作者，女，1965年4月生，博士，教授，研究方向:腦血管及多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，E-mail:zhiyusong@yeah.net

丁基苯酞對慢性腦缺血老齡大鼠腦組織TRPM2和核酸內(nèi)切酶G的影響

張會芳1)，盧 宏1)#，焦淑潔1)，劉 希2)

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州 450052 2)鄭州大學第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州 450052

#通訊作者，女，1965年4月生，博士，教授，研究方向:腦血管及多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，E-mail:zhiyusong@yeah.net

瞬時感受器電位M2型;核酸內(nèi)切酶G;慢性腦缺血;丁基苯酞;大鼠

目的:研究丁基苯酞(NBP)對老齡大鼠慢性腦缺血腦組織瞬時感受器電位M2型(TRPM2)及核酸內(nèi)切酶G(EndoG)表達的影響。方法:80只老齡Wistar大鼠隨機分為4組，每組20只，分別為假手術組、模型組、NBP低劑量治療組和NBP高劑量治療組。采用雙側頸總動脈永久結扎建立慢性腦缺血模型。3個月后，HE染色觀察腦組織形態(tài)學變化，免疫組化SP法染色檢測TRPM2和 EndoG的表達變化。結果:各組大鼠腦皮層與海馬區(qū)組織TRPM2和EndoG表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=310.046、127.115、49.959和80.292，P均＜0.05)。模型組皮質(zhì)和海馬TRPM2、EndoG表達較假手術組增多(P＜0.05)，而NBP低劑量和高劑量治療組較模型組減少(P＜0.05)，NBP高劑量組較低劑量治療組降低更加明顯(P＜0.05)。結論:NBP可能通過下調(diào)TRPM2和EndoG的表達，抑制細胞損傷和死亡，發(fā)揮對慢性缺血性腦組織的神經(jīng)保護作用。

慢性腦缺血是指各種原因導致大腦長期廣泛的血供不足，引發(fā)腦細胞缺血缺氧而出現(xiàn)的一系列神經(jīng)功能障礙性疾病。瞬時感受器電位M2型(transient receptor potential melastain 2，TRPM2)是位于細胞膜上的一類重要的非谷氨酸依賴的鈣離子通道，在神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布于腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，能在免疫反應中調(diào)控胞內(nèi)的鈣離子濃度［1］。核酸內(nèi)切酶G(endonuclease G，EndoG)是一種鈣離子依賴性內(nèi)切酶，活化的EndoG自線粒體中釋放入胞質(zhì)后，繼而轉位進入胞核引起染色體DNA斷裂，介導細胞凋亡［2］。丁基苯酞(dl-butylphthalide，NBP)是中國成功研制的治療急性缺血性卒中的一種化學新藥，能改善腦卒中后病灶周圍微循環(huán)、保護線粒體、抑制炎癥反應、阻斷鈣內(nèi)流等［3］，對急性腦缺血療效肯定，但在慢性腦缺血中是否能發(fā)揮神經(jīng)保護作用尚未見報道。作者建立慢性腦缺血動物模型，旨在觀察丁基苯酞對老齡大鼠腦組織中TRPM2和EndoG蛋白表達的影響，探討丁基苯酞對慢性腦缺血組織的神經(jīng)保護機制，為慢性腦缺血的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 兔抗TRPM2多克隆抗體購自美國Novus公司;兔抗EndoG多克隆抗體購自北京博奧森;SP和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。NBP(批號:050106)由恩必普藥業(yè)提供。

1.2 慢性腦缺血大鼠模型的建立 參照Ohta等［4］方法制作大鼠慢性腦缺血模型。手術前12 h禁食，術后4 h禁水。大鼠腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中線切開，分離雙側頸總動脈，雙重絲線結扎(2VO手術)。棄去術中出現(xiàn)呼吸困難、出血過多的大鼠。2VO術后飼養(yǎng)過程中，表現(xiàn)活潑，行動自如，正常攝食飲水，毛色光潔，眼部無異常分泌物，體質(zhì)量增加為模型成功。凡手術后3個月后死亡的大鼠不計在內(nèi)。

1.3 動物分組與處理 健康Wistar大鼠80只，雌雄不拘，鼠齡12～14個月，體質(zhì)量450～550 g，由河南省實驗動物中心提供。大鼠分為4組，每組20只。A組:除不結扎雙側頸總動脈，余同1.2;B組:模型組;C組:NBP低劑量治療組;D組:NBP高劑量治療組。C組和D組2VO術后2個月分別按60 mg/kg和120 mg/kg每天給予NBP灌胃，A組和B組每給予消毒后的精制花生油2 mL灌胃，皆灌1個月。1個月后，以水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉，迅速開胸暴露心臟和主動脈弓，經(jīng)左心室以200 mL生理鹽水加壓快速沖洗，斷頭取腦，隨后置于40 g/L多聚甲醛內(nèi)固定24 h，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋。

1.4 腦組織神經(jīng)細胞形態(tài)觀察 腦組織切片經(jīng)蒸餾水沖洗后，HE染色，光鏡下觀察。

1.5 腦組織TRPM2和EndoG蛋白的檢測 采用免疫組織化學SP法。TRPM2和EndoG兔多克隆抗體分別按1∶70和1∶30稀釋，嚴格按照說明書操作。以PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性標本作為陽性對照。TRPM2蛋白陽性免疫反應產(chǎn)物呈棕褐色，主要分布于細胞膜和(或)細胞質(zhì)。EndoG蛋白陽性免疫反應產(chǎn)物也呈棕黃色或棕褐色，主要分布于細胞質(zhì)和(或)細胞核。每個標本隨機取6張切片，在皮層和海馬各隨機選取5個高倍視野(× 400)，彩色病理圖像分析儀采集圖像，圖像分析系統(tǒng)，分析TRPM2與EndoG平均積分光密度值。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0進行分析，各組腦組織TRPM2和EndoG蛋白表達的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài) A組大鼠顳葉皮層和海馬神經(jīng)元大部分形態(tài)正常，神經(jīng)元排列緊密，神經(jīng)元胞核圓、藍色著色，細胞質(zhì)豐富，胞體完整，偶見變性和死亡神經(jīng)元。B組大部分神經(jīng)元消失，胞體縮小，胞質(zhì)濃縮，呈現(xiàn)深藍著色，在細胞核周圍可見空穴，正常神經(jīng)元數(shù)目較少，排列紊亂，有的胞質(zhì)不均勻，內(nèi)有空泡。C組大鼠顳葉皮層和海馬神經(jīng)元較B組消失減少，可見部分變性和死亡神經(jīng)元。D組雖然在大鼠顳葉皮層和海馬可以發(fā)現(xiàn)小部分變性和死亡神經(jīng)元，但是其組織形態(tài)較B組有明顯的好轉，較C組也有部分改善。見圖1。

圖1 各組大鼠皮質(zhì)(1)和海馬區(qū)(2)神經(jīng)細胞形態(tài)(HE，×400)

2.2 各組大鼠腦組織TRPM2和EndoG蛋白的表 達 見圖2、表1。

圖2 各組大鼠海馬和皮層中TRPM2和EndoG蛋白的表達(SP，×400)

表1 各組大鼠海馬和皮層中TRPM2及EndoG積分光密度值比較

3 討論

慢性腦缺血損傷中會產(chǎn)生活性氧及氮類物質(zhì)，而神經(jīng)細胞過度暴露于以上物質(zhì)，則會發(fā)生類似凋亡的遲發(fā)性死亡和壞死［5］。TRPM2是一種廣泛分布于細胞膜上非谷氨酸依賴的Ca2+選擇性的陽離子通道，為瞬時受體電位通道超家族中的一員［6］。TRPM2的生理作用極可能是通過調(diào)控細胞內(nèi)的鈣離子濃度而實現(xiàn)的。其在氧化應激中充當正反饋信號［1］，其在氧化應激或氧-葡萄糖剝離狀態(tài)下DNA損傷和修復過程中產(chǎn)生大量的ADP-核糖，此物質(zhì)能激活TRPM2通道。最初認為TRPM2通道僅存在于膠質(zhì)細胞中，后來研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細胞膜中也表達此類通道蛋白［4］。有研究［7］表明，TRPM2通道的激活與細胞死亡率之間呈現(xiàn)正相關。在體外試驗中以反義RNA下調(diào)TRPM2基因表達，或是培養(yǎng)TRPM2基因缺陷細胞，都可發(fā)現(xiàn)細胞存活率上升［8］。因此有人認為TRPM2通道抑制劑也許能改善炎癥/缺血中的細胞存活率，但目前尚未發(fā)現(xiàn)TRPM2的特異抑制劑［4］。該實驗結果顯示慢性腦缺血能誘導 TRPM2表達，而NBP可劑量依賴性下調(diào)TRPM2蛋白的表達，這可能與NBP抑制炎癥反應，減少ADPR、H2O2等 TRPM2通道激活物質(zhì)的生成，從而抑制TRPM2通道的活化及在ROS/RAS中的正反饋作用有關，但其具體機制有待進一步研究。

EndoG是一種由核基因編碼的存在于真核細胞線粒體膜間區(qū)的鈣離子依賴性核酸酶，主要與DNA修復和線粒體 DNA復制相關［9］。EndoG為非caspase依賴的線粒體蛋白，介導細胞的凋亡［10］。胞質(zhì)鈣離子濃度升高被認為是細胞凋亡的啟動因素之一。韓恩吉等［11］在鈣載體和PC12細胞株實驗中再次證實了胞質(zhì)鈣離子升高-激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶-DNA在核小體間斷裂-神經(jīng)細胞凋亡的過程。Caspase依賴性機制在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用［12］，但caspase非依賴性機制也參與了遲發(fā)性神經(jīng)元死亡［13］。正常情況下EndoG在腦組織中僅少量表達于衰老細胞中。在促凋亡因素(如tBid、Bax、鈣及化療藥物)的刺激下，線粒體膜的通透性增加，定位于線粒體膜間隙的EndoG轉位至胞質(zhì)，進而進入胞核，引起染色體DNA斷裂導致細胞凋亡［14］。該實驗中，模型組中大鼠腦組織可觀察到大量的EndoG陽性細胞，提示慢性缺血能誘導神經(jīng)細胞經(jīng)EndoG途徑凋亡，予以NBP干預后EndoG蛋白表達水平劑量依賴性下降，推測NBP可能通過某種途徑保護線粒體，減少線粒體APT通道的開放，從而抑制EndoG從線粒體釋放及轉位，減少神經(jīng)細胞凋亡。

綜上所述，NBP可能通過某種途徑抑制TRPM2通道蛋白的活化，減輕非谷氨酸依賴的鈣離子通道所介導的鈣超載，減少線粒體APT通道的開放，進而減少線粒體中內(nèi)源性EudoG的釋放，發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。

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Effects of dl-butylphthalide on expressions of TRPM2 and EndoG in brain tissues of aged rats with chronic cerebral ischemia

ZHANG Huifang1)，LU Hong1)，JIAO Shujie1)，LIU Xi2)1)Department of Neurology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500522)Department of Neurology，the Fifth Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

transient receptor potential melastain 2;endonuclease G;chronic cerebral ischemia;dl-butylphthalide;rat

Aim:To investigate the influences of dl-butylphthalide(NBP)on the expressions of transient receptor potential melastain 2(TRPM2)and endonuclease G(EndoG)after chronic cerebral ischemia in aged rats.Methods:A total of 80 aged male Wistar rats were randomly divided into 4 groups，sham-operated group，model group，low-dose NBP-treated group and high-dose NBP-treated group.Chronic cerebral ischemia model was based on permanent bilateral occlusion of both common carotid arteries.The rats were sacrificed after 3 months.The changes of morphology of brain were observed by HE staining and the expressions of TRPM2 and EndoG were observed by immunohistochemistry.Results:The expressions of TRPM2 and EndoG in cortex and hippocampus of the four groups were significantly different(F=310.046，127.115，49.959，and 8.292，P＜0.05).The expressions of TRPM2 and EndoG in cortex and hippocampus of model group were more than those of shamoperated group，and those of low and high dose NBP-treated groups were significantly less than those of model group(P＜0.05)，and the high dose group changed more apparently.Conclusion:NBP may have neuroprotective effects，which may result from its decreasing the expression of TRPM2 and EndoG after chronic ischemia，thus inhibiting the injury and death of the cells.

R743

(2011-03-15收稿 責任編輯李沛寰)