普羅布考對過氧化氫誘導的大鼠心肌細胞凋亡及氧化應激水平的影響*

羅 萍，杜 松，段紅艷，李海霞

1)河南省人民醫院心內科鄭州 450003 2)河南省人民醫院檢驗科鄭州 450003

△女，1977年9月生，碩士，主治醫師，研究方向:冠心病的基礎與臨床，E-mail:TJXLLP@163.com

普羅布考對過氧化氫誘導的大鼠心肌細胞凋亡及氧化應激水平的影響*

羅 萍1)△，杜 松1)，段紅艷1)，李海霞2)

1)河南省人民醫院心內科鄭州 450003 2)河南省人民醫院檢驗科鄭州 450003

△女，1977年9月生，碩士，主治醫師，研究方向:冠心病的基礎與臨床，E-mail:TJXLLP@163.com

普羅布考;過氧化氫;丙二醛;超氧化物歧化酶;Bax;Bcl-2;凋亡;大鼠;心肌細胞

目的:探討普羅布考對過氧化氫(H2O2)誘導的心肌細胞凋亡的影響，探討其可能的機制。方法:培養的新生大鼠心肌細胞隨機分組，分別給予0、1、10和100 μmol/L普羅布考預處理6 h后，再給予0.2 mmol/L H2O2繼續孵育6 h。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，RT-PCR法檢測細胞Bcl-2及Bax mRNA的表達，黃嘌呤氧化酶法測定細胞內超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸法檢測細胞內丙二醛(MDA)含量。結果:普羅布考劑量依賴性地抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡，降低心肌細胞Bax mRNA表達，升高Bcl-2 mRNA表達，升高心肌細胞SOD活性，降低MDA含量。結論:普羅布考可抑制H2O2誘導的乳鼠心肌細胞凋亡，其作用機制與改善心肌細胞氧化應激水平有關。

心臟受到各種損傷后氧化應激水平顯著升高。氧化應激可誘導炎癥反應和細胞凋亡，從而導致心室重構和進行性心力衰竭［1］。普羅布考為一種脂溶性強抗氧化劑，能通過細胞膜浸潤至心肌細胞內，直接清除細胞內的氧自由基。普羅布考可能通過在細胞內外抑制氧化應激，影響心肌凋亡調控基因，從而減輕心肌細胞的凋亡，保護心功能［2］。作者觀察了普羅布考對H2O2誘導的乳鼠心肌細胞凋亡的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 新生1～3 d的Wistar大鼠(鄭州大學實驗動物中心)。DMEM培養基、新生小牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司);Trizol裂解液(Invitrogene公司);dNTPs、OligodT18、AMV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、Taq酶(TaKaRa公司)，瓊脂糖(Sigma公司);普羅布考(齊魯制藥廠);H2O2(天津廣成試劑公司);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所); AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術有限公司)。

1.2 乳鼠心肌細胞原代培養 參照Simpson等［3］的方法，采用酶消化法分離心肌細胞進行培養。無菌取出新生大鼠心臟，用無菌D-Hanks液漂洗2次，剪除大血管和心房，再用無菌D-Hanks液洗凈心腔血液后，轉移至無菌青霉素小瓶中，將心肌組織剪成1 mm3大小的碎塊，加入0.6 g/L胰蛋白酶8～10 mL，37℃低速磁力攪拌消化6～8次，每次10 min，直至組織塊消化完為止。棄去第1次消化上清液，收集此后的每次上清液，加入37℃預熱的含小牛血清的DEME培養基以中和胰蛋白酶，1 500 r/min離心6 min，棄上清。將沉淀用含體積分數20%小牛血清的DEME培養基制成細胞懸液，經貼壁1.5 h除去成纖維細胞分離純化后，調整為0.5×109L－1接種于培養瓶中，置體積分數5%CO2培養箱中37℃培養。隔日更換培養基，3～4 d后，待細胞融合貼滿瓶底且有節律同步搏動時，取原代細胞進行實驗。1.3 實驗分組及處理 將體外培養的原代大鼠心肌細胞隨機分為4組，每組6瓶細胞。H2O2組加入0.2 mmol/L H2O2，其他3組分別予以1、10和100 μmol/L普羅布考預處理6 h后，再加入0.2 mmol/L H2O2繼續孵育6 h。

1.4 觀測指標

1.4.1 細胞凋亡測定 取4組處理后的心肌細胞用12.5 g/L胰蛋白酶消化，調節細胞濃度為1×106L－1，按AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒說明書操作，經流式細胞儀檢測，記錄細胞凋亡率。

1.4.2 心肌細胞內SOD活性及MDA含量測定細胞內SOD活性和MDA含量測定分別按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 Bax及Bcl-2 mRNA檢測 用Primer 5.0軟件設計Bcl-2、Bax和內參照基因GAPDH的PCR引物。引物序列及產物長度見表1。取經過處理的心肌細胞，提取總RNA，逆轉錄為cDNA，在PCR儀上擴增，產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，以目的基因條帶與內參條帶灰度值的比值作為目的基因mRNA的相對表達量。

表1 目的基因PCR引物序列及產物長度

1.5 統計學處理 用SPSS 11.5進行統計分析。4組細胞凋亡率、Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的相對表達量，細胞內SOD活性和MDA含量的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組心肌細胞凋亡率測定結果 經不同劑量普羅布考預處理后，H2O2誘導的乳鼠心肌細胞凋亡率均明顯下降，且細胞凋亡率隨普羅布考劑量的升高而降低，見表2。

2.2 4組心肌細胞Bax及Bcl-2 mRNA的表達與H2O2組相比，不同劑量普羅布考組Bax mRNA的表達均明顯下降，而Bcl-2 mRNA表達均明顯升高，且呈劑量依賴性，見圖1及表2。

2.34組心肌細胞內SOD活性及MDA含量測定結果 與H2O2組相比，普羅布考組細胞內SOD活性均升高，MDA含量均降低，且呈劑量依賴性，見表2。

4組心肌細胞Bax(上)及Bcl-2(下)mRNA的表達

表2 普羅布考對心肌細胞凋亡及氧化應激的影響

3 討論

氧化應激是指細胞中促氧化與抗氧化體系之間的平衡失調而傾向于前者所導致的一種細胞內穩態紊亂。促氧化作用主要由活性氧來完成。活性氧包括過氧化氫、單態氧、超氧負離子及羥基等，它們通過多種途徑損害心肌組織，包括激活基質金屬蛋白酶參與細胞外基質重塑，作為信號分子參與心肌肥厚，誘發心肌細胞凋亡，損傷內皮細胞和激活炎癥因子生成等［1］。

已有研究［4］證實活性氧與心肌細胞凋亡密切相關。活性氧主要通過線粒體信號轉導通路、P53通路及TNF-α通路引起心肌細胞凋亡。Bcl-2家族是與凋亡密切相關的基因群，它通過調節線粒體膜的通透性和凋亡蛋白的釋放調控細胞凋亡。Bcl-2家族被分為兩類，一類為前凋亡蛋白，包括Bax、Bad及Bak等，另一類為抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、BCI-XL及BCL-W等［5］。前凋亡蛋白轉位到線粒體膜上可促進線粒體內的凋亡蛋白釋放。抗凋亡蛋白與前凋亡蛋白結合，可阻止其促凋亡作用［6］。在心肌細胞中，氧化應激能使Bax表達增加，Bcl-2表達下降，線粒體膜通透性增高，促細胞發生凋亡［7］。

Lou等［8］研究顯示普羅布考可抑制阿霉素所致擴張型心肌病的心肌細胞凋亡。Ruixing等［9］研究表明普羅布考可減少兔缺血-再灌注損傷的心肌細胞凋亡。Oskarsson等［10］及Kumar等［11］發現普羅布考明顯抑制Bax的表達而減少心肌細胞凋亡。該研究結果顯示，普羅布考預處理可劑量依賴性地減少H2O2誘導的乳鼠心肌細胞凋亡率及前凋亡蛋白Bax mRNA的表達，升高抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA的表達，提示普羅布考可能通過干擾線粒體的致凋亡途徑發揮抑制細胞凋亡的作用。作者還觀察到普羅布考預處理可劑量依賴性地減少H2O2誘導的乳鼠心肌細胞內MDA含量，提高SOD活性。MDA是脂質過氧化的終產物，是研究抗氧化能力的常用指標之一。SOD是生物體內清除氧自由基的重要酶類，可減輕氧離子損傷，其活性高低可以間接反映體內氧自由基清除能力。這一結果提示普羅布考能有效降低心肌細胞氧化應激水平。提示普羅布考可能通過降低氧化應激水平，從而抑制了心肌細胞的凋亡。

總之，該實驗在離體心肌細胞水平觀察到普羅布考能有效減少H2O2所致的細胞凋亡，這一效應可能部分通過改善心肌氧化應激水平，干擾線粒體信號轉導通路來實現，但作用的具體途徑仍未完全闡明，還需進一步探討。

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［2］Sia YT，Lapointe N，Parker TG，et al.Beneficial effects of long-term use of the antioxidant probucol in heart failure in the rat［J］.Circulation，2002，105(21):2549

［3］Simpson P，Savion S.Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells.Cross-striations，ultrastructure，and chronotropic response to isoproterenol［J］.Circ Res，1982，50(1):101

［4］ Long X，Goldenthal MJ，Marín-García J.Mol Cell Biochem.Oxidative stress enhances phosphorylation of p53 in neonatal rat cardiomyocyte［J］.2007，303(1/2):167

［5］ Bhathena SJ，Velasquez MT.Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes［J］.Am J Clin Nutr，2002，76(6):1191

［6］Choi YH，Kong KR，Kim YA，et al.Induction of Bax and activation of caspases during beta-sitosterol-mediated apoptosis in human colon cancer cells［J］.Int J Oncol，2003，23(6):1657

［7］Valks DM，Kemp TJ，Clerk A，et al.Regulation of Bcl-xL expression by H2O2in cardiac myocytes［J］.J Biol Chem，2003，278(28):25542

［8］Lou H，Danelisen I，Singal PK.Involvement of mitogenactivated protein kinases in adriamycin-induced cardiomyopathy［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，288 (4):H1925

［9］Ruixing Y，Al-Ghazali R，Wenwu L，et al.Pretreatment with probucol attenuates cardiomyocyte apoptosis in a rabbit model of ischemia/reperfusion［J］.Scand J Clin Lab Invest，2006，66(7):549

［10］Oskarsson HJ，Coppey L，Weiss RM，et al.Antioxidants attenuate myocyte apoptosis in the remote non-infarcted myocardium following large myocardial infarction［J］.Cardiovasc Res，2000，45(3):679

［11］Kumar D，Kirshenbaum LA，Li T，et al.Apoptosis in adriamycin cardiomyopathy and its modulation by probucol［J］.Antioxid Redox Signal，2001，3(1):135

Inhibition of probucol on cultured neonatal rat cardiomyocyte apoptosis induced by hydrogen peroxide

LUO Ping1)，DU Song1)，DUAN Hongyan1)，LI Haixia2)1)Department of Cardiology，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003 2)Department of Clinical Laboratory，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003

probucol;hydrogen peroxide;malondialdehyde;superoxide dismutase;Bax;Bcl-2;apoptosis;rat;cardiomyocyte

Aim:To observe the effect of probucol on cardiomyocyte apoptosis induced by hydrogen peroxide(H2O2) and to explore its possible mechanisms.Methods:Cultured neonatal rat cardiomyocytes were randomly divided into 4 groups，and were given 0，1，10，and 100 μmol/L probucol pretreatment for 6 h，respectively，and then induced by 0.2 mmol/L H2O2for 6 h.Apoptosis cells were assessed by flow cytometry.The mRNA expression of Bcl-2 and Bax in cardiomyocytes was determined by RT-PCR.The superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)contents in cells were tested by xanthine oxidase method and color reaction of thiobarbituric acid method，respectively.Results:Probucol decreased cardiomyocyte apoptosis induced by H2O2and Bax mRNA expression，increased Bcl-2 mRNA expression，increased SOD activity and decreased the MDA content significantly.All these effects were in a dose-dependent manner.Conclusion:Probucol could inhibit cardiomyocyte apoptosis induced by H2O2partly by reducing the oxidative stress level.

R972

*河南省科技廳基礎與前沿項目資助課題 112300410049

(2011-02-11收稿 責任編輯王 曼)